347 12.7 * 1.24mm Irin alagbara, irin wiwu ọpọn, ẹrọ molikula ti amuṣiṣẹpọ electrostatic condensation ati coaggregation ti α-synuclein ati tau

O ṣeun fun lilo si Nature.com.O nlo ẹya ẹrọ aṣawakiri kan pẹlu atilẹyin CSS lopin.Fun iriri ti o dara julọ, a ṣeduro pe ki o lo ẹrọ aṣawakiri imudojuiwọn kan (tabi mu Ipo Ibamu ṣiṣẹ ni Internet Explorer).Ni afikun, lati rii daju atilẹyin ti nlọ lọwọ, a fihan aaye naa laisi awọn aza ati JavaScript.
Sliders nfihan awọn nkan mẹta fun ifaworanhan.Lo awọn ẹhin ati awọn bọtini atẹle lati gbe nipasẹ awọn ifaworanhan, tabi awọn bọtini idari ifaworanhan ni ipari lati gbe nipasẹ ifaworanhan kọọkan.

347 Alagbara Irin Pipe Specification

347 12.7 * 1.24mm Irin alagbara, irin fifẹ ọpọn

Ita opin: 6.00 mm OD soke si 914.4 mm OD, Awọn iwọn to 24 "NB wa Ex-iṣura, OD Iwọn Irin tubes wa Ex-iṣura

SS 347 Ibi sisanra Pipe: 0.3mm - 50 mm, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S, ati be be lo (0.5-12mm) Tabi ti kii ṣe deede iwọn lati wa ni sile bi beere

iru: SS 347 Seamless Pipes |SS 347 ERW Pipes |SS 347 Welded Pipes |SS 347 Fabricated Pipes |SS 347 CDW Falopiani, LSAW Pipes / Seam-welded / Redrawn

Fọọmu: SS 347 Awọn paipu Yika / Awọn tubes, SS 347 Square Pipes / tubes, SS 347 Pipe / tubes, SS 347 Coiled Tubes, SS 347 "U" Apẹrẹ, SS 347 Pan Cake Coils, SS 347 Hydraulic Tubes

Ipari: ID Kanṣoṣo, Ailewu meji & Ipari Gigun ti a beere: Ipari pẹtẹlẹ, Ipari Beveled, Titẹ

Ipari Idaabobo: Ṣiṣu fila |Ipari ita: 2B, No.4, No.1, No.8 Digi Ipari fun Awọn ọpa irin alagbara, Pari gẹgẹbi awọn ibeere onibara

Ipo Ifijiṣẹ: Annealed ati Pickled, didan, Annealed Annealed, Tutu Yaworan

Ayewo, Awọn ijabọ Idanwo: Awọn iwe-ẹri Idanwo Mill, EN 10204 3.1, Awọn ijabọ Kemikali, Awọn ijabọ Imọ-ẹrọ, Awọn ijabọ Idanwo PMI, Awọn ijabọ Iwowo wiwo, Awọn ijabọ Iyẹwo Ẹkẹta, Awọn ijabọ Lab ti NABL ti fọwọsi, Iroyin Idanwo iparun, Awọn ijabọ Idanwo Apanirun

Iṣakojọpọ: Ti kojọpọ ninu Awọn apoti Onigi, Awọn baagi ṣiṣu, Awọn ila irin ti a dipọ, tabi gẹgẹ bi Awọn ibeere Onibara

Awọn Pataki: Awọn iwọn ati Awọn pato yatọ si oke le jẹ iṣelọpọ lori ibeere

SS 347 Iwọn Iwọn Paipu: 1/2 inch NB, OD si 24 inch

ASTM A312 347 Ailokun ati oju-ọna taara welded paipu austenitic ti a pinnu fun iwọn otutu giga ati iṣẹ ibajẹ gbogbogbo.Filler irin ko gba ọ laaye nigba alurinmorin.

ASTM A358 347: Ijọpọ itanna welded paipu austenitic fun ibajẹ ati/tabi iṣẹ iwọn otutu giga.Ni deede paipu nikan to 8 inch ni a ṣe si sipesifikesonu yii.Afikun irin kikun jẹ idasilẹ lakoko alurinmorin.

ASTM A790 347: Ailokun ati oju-ọna taara welded ferritic/austenitic (duplex) paipu ti a pinnu fun iṣẹ ibajẹ gbogbogbo, pẹlu tcnu pataki kan lori resistance si wahala ipata wo inu.

ASTM A409 347: Isopọ taara tabi ajija-ipo itanna idapọmọra welded iwọn ila opin nla austenitic paipu ina-ogiri ni awọn iwọn 14 si 30” pẹlu awọn odi Sch5S ati Sch 10S fun ibajẹ ati / tabi giga

ASTM A376 347: paipu austenitic ti ko ni ailopin fun awọn ohun elo iwọn otutu giga.

ASTM A813 347: Oju-ọkọ kan, ẹyọkan tabi meji-welded paipu austenitic fun iwọn otutu giga ati awọn ohun elo ibajẹ gbogbogbo.

ASTM A814 347: paipu austenitic alurinmorin ti a ṣiṣẹ tutu fun iwọn otutu giga ati iṣẹ ibajẹ gbogbogbo.

347H Irin alagbara, irin Pipes Kemikali Tiwqn

Irin Alagbara, Irin 347H Pipe Mechanical Properties

Irin alagbara, irin 347H Pipes Physical Properties

Awọn ipele deede fun paipu Irin Alagbara 347H

Amyloid alpha-synuclein (αS) aggregation jẹ aami ami aisan ti Parkinson ati awọn synucleinopathies miiran.Laipe yii, amuaradagba tau ti o wọpọ pẹlu arun Alzheimer ti ni nkan ṣe pẹlu imọ-jinlẹ αS ati pe a rii lati ṣepọ-agbegbe ni awọn ifisi-ọlọrọ αS, botilẹjẹpe ẹrọ molikula ti iṣakojọpọ ti awọn ọlọjẹ meji ko ṣiyeju.A ṣe ijabọ nibi pe ipele αS yapa si awọn condensates olomi nipasẹ condensation eka elekitiroti pẹlu awọn polypeptides ti o ni agbara daadaa gẹgẹbi tau.Ti o da lori isunmọ ti αS fun awọn polycations ati oṣuwọn ti valence idinku ti nẹtiwọọki coagulation, awọn didi ni iyara gelation tabi iṣọpọ ti o tẹle pẹlu apapọ amyloid ti o lọra.Nipa pipọpọ akojọpọ awọn ilana imọ-ẹrọ biophysical to ti ni ilọsiwaju, a ni anfani lati ṣe afihan iyapa αS/Tau olomi-omi ati ṣe idanimọ awọn ifosiwewe bọtini ti o yori si dida awọn akojọpọ oriṣiriṣi ti o ni awọn ọlọjẹ mejeeji ni condensate amuaradagba olomi.
Ni afikun si awọn ipin awo awọ, iyapa aaye ninu awọn sẹẹli tun le ṣe aṣeyọri nipasẹ dida awọn ọlọrọ-amuaradagba, awọn ara ipon omi-bi ti a pe ni awọn condensates biomolecular tabi droplets, nipasẹ ilana ti a mọ ni ipinya omi-omi-omi (LLPS).Wọnyi droplets ti wa ni akoso nipasẹ multivalent awọn ibaraenisepo igba die, nigbagbogbo laarin awọn ọlọjẹ tabi awọn ọlọjẹ ati RNA, ati ki o sin kan orisirisi ti awọn iṣẹ ni fere gbogbo awọn ọna šiše alãye.Nọmba nla ti awọn ọlọjẹ ti o ni agbara LLP ṣe afihan awọn ilana ti idiju kekere ti o ni rudurudu pupọ ni iseda ati ni dida awọn condensates biomolecular3,4,5.Ọpọlọpọ awọn ijinlẹ esiperimenta ti ṣafihan irọrun, nigbagbogbo rudurudu, ati ẹda pupọ ti awọn ọlọjẹ ti o jẹ iru awọn condensates bii omi-omi, botilẹjẹpe diẹ ni a mọ nipa awọn ipinnu molikula kan pato ti o ṣakoso idagbasoke ati maturation ti awọn condensates wọnyi si bii ti o lagbara diẹ sii. ipinle..
Awọn data tuntun ṣe atilẹyin idawọle pe LLPS ti o ni amuaradagba aberrant ati iyipada ti awọn droplets sinu awọn ẹya ti o lagbara le jẹ awọn ipa ọna cellular ti o ni ibatan ti o yori si dida awọn akopọ majele ti a ko le sọ di mimọ ti o jẹ ami iyasọtọ ti awọn arun degenerative.Ọpọlọpọ awọn ọlọjẹ ti o ni nkan ṣe pẹlu LLPS (IDPs), nigbagbogbo gba agbara pupọ ati rọ, ti pẹ ni nkan ṣe pẹlu neurodegeneration nipasẹ ilana ti amyloid aggregation.Ni pato, awọn condensates IDP biomolecular gẹgẹbi FUS7 tabi TDP-438 tabi awọn ọlọjẹ pẹlu awọn agbegbe idiju kekere ti o tobi gẹgẹbi hnRNPA19 ti han si ọjọ ori sinu gel-like tabi paapaa awọn fọọmu ti o lagbara nipasẹ ilana ti a npe ni fifa omi.agbo.si iyipada alakoso ti o lagbara (LSPT) gẹgẹbi iṣẹ ti akoko tabi ni idahun si awọn iyipada lẹhin-itumọ tabi awọn iyipada ti o ṣe pataki ti pathologically1,7.
IDP miiran ti o ni nkan ṣe pẹlu LLPS ni vivo jẹ Tau, amuaradagba ti o ni nkan ṣe pẹlu microtubule ti o ni ibatan si amyloid aggregation ninu Arun Alzheimer10 ṣugbọn tun ti ni ipa laipẹ ni Arun Arun Parkinson (PD) ati awọn proteinopathies iparun synaptic miiran 11, 12, 13 ni ibatan.Tau ti ṣe afihan lati ya sọtọ lẹẹkọkan lati ojutu/cytoplasm nitori awọn ibaraenisepo elekitirositati o wuyi14, ti o yọrisi didasilẹ ti awọn droplets ti o ni imudara tau ti a mọ si electrostatic coacervates.O tun ti ṣe akiyesi pe iru ibaraenisepo ti kii ṣe pato ni agbara awakọ lẹhin ọpọlọpọ awọn condensates biomolecular ni iseda15.Ninu ọran ti amuaradagba tau kan, ikojọpọ elekitiroti le ṣe agbekalẹ nipasẹ iṣakojọpọ ti o rọrun, ninu eyiti awọn agbegbe ti o gba agbara ni idakeji ti amuaradagba nfa ilana fifọ, tabi nipasẹ ikojọpọ eka nipasẹ ibaraenisepo pẹlu awọn polima ti ko ni agbara bi RNA.
Laipe, α-synuclein (αS), amyloid IDP ti o ni ipa ninu PD ati awọn aarun neurodegenerative miiran ti a mọ ni apapọ bi synucleinopathy17,18, ti ṣe afihan ni cellular ati awọn awoṣe ẹranko19,20 ti o ni idojukọ ninu awọn condensates amuaradagba pẹlu ihuwasi iru-omi.Awọn ijinlẹ in vitro ti fihan pe αS gba LLPS nipasẹ ikojọpọ ti o rọrun nipasẹ awọn ibaraenisepo hydrophobic ti o bori, botilẹjẹpe ilana yii nilo awọn ifọkansi amuaradagba giga ti o ga julọ ati ni igbagbogbo awọn akoko idabo19,21.Boya awọn condensates ti o ni αS ti a ṣe akiyesi ni vivo jẹ idasile nipasẹ eyi tabi awọn ilana LLPS miiran jẹ ọrọ bọtini ti a ko yanju.Bakanna, biotilejepe αS amyloid aggregation ti a ti woye ni awọn neurons ni PD ati awọn miiran synucleinopathies, awọn ilana gangan nipa eyi ti αS faragba intracellular amyloid aggregation si maa wa koyewa, bi overexpression ti yi amuaradagba ko han lati ma nfa ilana yi nipa ara.Awọn ibajẹ cellular afikun ni a nilo nigbagbogbo, ni iyanju pe awọn ipo cellular tabi awọn microenvironment ni a nilo fun isọdọtun ti awọn apejọ amyloid intracellular αS intracellular.Ayika cellular kan ti o ni itara si iṣakojọpọ le jẹ inu inu awọn condensates amuaradagba 23.
O yanilenu, αS ati tau ni a ti rii lati ṣepọ-agbegbe ni awọn ifisi arun ti ihuwasi ninu eniyan pẹlu arun Arun Parkinson ati awọn miiran synucleinopathies 24,25 ati awọn adanwo ti royin ibatan iṣọn-alọ ọkan laarin awọn ọlọjẹ meji 26,27 ni iyanju ibatan ti o pọju laarin apapọ αS ati tau ni neurodegenerative arun.àìsàn.αS ati tau ni a ti rii lati ṣe ajọṣepọ ati igbega iṣakojọpọ ara wọn ni vitro ati ni vivo 28,29 ati awọn akojọpọ oriṣiriṣi ti o ni awọn ọlọjẹ meji wọnyi ni a ti ṣe akiyesi ni ọpọlọ ti awọn alaisan pẹlu synucleinopathies 30.Bibẹẹkọ, diẹ ni a mọ nipa ipilẹ molikula ti ibaraenisepo laarin αS ati tau ati ilana ti iṣakojọpọ rẹ.A ti royin αS lati ṣe ajọṣepọ pẹlu tau nipasẹ ifamọra elekitiroti laarin agbegbe C-terminal ti o gba agbara ni odi pupọ ti αS ati agbegbe proline-ọlọrọ ti tau, eyiti o tun jẹ idarato ni awọn iṣẹku ti o gba agbara daadaa.
Ninu iwadi yii, a fihan pe αS le nitootọ pin si awọn droplets nipasẹ isọdọtun eka elekitiroti ni iwaju ti amuaradagba tau, ni idakeji si ibaraenisepo rẹ pẹlu awọn polypeptides miiran ti o daadaa gẹgẹbi poly-L-lysine (pLK), ati ninu ilana yii.αS n ṣiṣẹ bi moleku scaffold fun netiwọki droplet.A ti ṣe akiyesi awọn iyatọ ti o ṣe akiyesi ni ilana ti maturation ti electrostatic αS coacervates, eyiti o ni nkan ṣe pẹlu awọn iyatọ ninu valency ati agbara ti ibaraenisepo ti awọn ọlọjẹ ti o ni ipa ninu nẹtiwọki coacervate.O yanilenu, a ṣe akiyesi iṣakojọpọ ti αS ati awọn ọlọjẹ amyloid tau ni awọn coacervates olomi gigun ati ṣe idanimọ diẹ ninu awọn ifosiwewe bọtini ti o yorisi iṣakojọpọ ti awọn ọlọjẹ meji wọnyi ni iru awọn alamọdaju.Nibi a ṣe apejuwe ilana yii ni alaye, eyiti o jẹ ilana molikula ti o ṣeeṣe ti o wa labẹ isọdọmọ ti awọn ọlọjẹ meji ni awọn ifisi-aisan kan pato.
αS ni iru C-terminal anionic ti o ga julọ ni pH didoju (Fig. 1a), ati pe a pinnu pe o le faragba LLPS nipasẹ isunmọ ti awọn eka elekitirosita pẹlu awọn ohun elo polypeptide polycationic disordered.A lo 100-residue poly-L-lysine (pLK) gẹgẹbi apẹrẹ awoṣe ti o bẹrẹ nitori idiyele ti o daadaa ati ẹda polymeric ti o ni rudurudu ni pH didoju 32. Ni akọkọ, a jẹrisi pe pLK ṣe ajọṣepọ pẹlu agbegbe Ct ti αS nipasẹ Solusan NMR spectroscopy (Aworan 1b) ni lilo 13C/15N-aami αS ni iwaju ti npo αS: pLK molar ratios.Ibaraṣepọ ti pLK pẹlu Ct-ašẹ ti αS ṣe afihan ararẹ ni awọn aiṣedeede ti iyipada kemikali ati idinku ninu kikankikan tente oke ni agbegbe ti amuaradagba yii.O yanilenu, nigba ti a dapọ αS pẹlu pLK ni ifọkansi αS ti isunmọ.5-25 µM ni iwaju polyethylene glycol (5-15% PEG-8) (aṣoju LLPS buffer: 10 mM HEPES pH 7.4, 100 mM NaCl, 15% PEG-8) a lọ lẹsẹkẹsẹ nipasẹ aaye nla ti iṣelọpọ amuaradagba. .A ṣe akiyesi awọn droplets nipa lilo fluorescence (WF) ati aaye-imọlẹ (BF) microscopy (Fig. 1c).1-5 µm droplets ti o ni awọn αS ogidi (fikun 1 µM AlexaFluor488-aami αS, AF488-αS), awọn ohun-ini elekitiroti wọn le jẹ yo lati resistance wọn si 10% 1,6-hexanediol (1,6-HD) ati ifamọ si ilosoke ninu ifọkansi NaCl (Fig. 1c).Iseda-omi-ara ti awọn coacervates ti eka elekitirosita αS/pLK jẹ afihan nipasẹ agbara wọn lati dapọ laarin awọn milliseconds (Fig. 1d).Lilo turbidimetry, a ṣe iwọn dida awọn droplets labẹ awọn ipo wọnyi, jẹrisi iseda elekitiroti ti ibaraenisepo akọkọ ti o ni nkan ṣe pẹlu iduroṣinṣin rẹ (Fig. 1e), ati ṣe iṣiro ipa ti ọpọlọpọ awọn ipin polima lori ilana LLPS (Fig. 1f).Botilẹjẹpe a ṣe akiyesi idasile droplet lori ọpọlọpọ awọn ipin polima, ilana naa dara pupọ nigbati pLK ba pọ ju αS.Awọn LLP tun ti ṣe akiyesi ni lilo kemikali ti o yatọ nipo asoju dextran-70 (70 kDa) tabi lilo ọpọlọpọ awọn ọna kika apẹẹrẹ, pẹlu ifaworanhan gilasi, awọn kanga microplate ti awọn ohun elo lọpọlọpọ, Eppendorf tabi quartz capillaries.
Aṣoju Sikematiki ti awọn agbegbe amuaradagba oriṣiriṣi ni WT-αS ati awọn iyatọ ΔCt-αS ti a lo ninu iwadii yii.Ibugbe N-terminal amphipathic, agbegbe hydrophobic amyloid-forming (NAC), ati agbara agbara odi C-terminal ni a fihan ni buluu, osan, ati pupa, lẹsẹsẹ.Maapu WT-αS ti o han ni Owo Nẹtiwọki Fun Ikuku (NCPR).b NMR ti ibaraenisepo αS/pLK ni aini ti awọn iṣupọ macromolecular.Bi ifọkansi pLK ṣe pọ si (αS: pLK molar ratios ti 1:0.5, 1:1.5, ati 1:10 ni a fihan ni alawọ ewe ina, alawọ ewe, ati alawọ ewe dudu, lẹsẹsẹ).c Coacervate αS/pLK (ipin molar 1:10) ni 25 µM (1 µM AF488-aami αS tabi Atto647N-ike pLK fun aworan WF) ni ifipamọ LLPS (oke) tabi afikun pẹlu 500 mM NaCl (isalẹ osi) tabi % 1,6-hexanediol (1,6-HD; isalẹ ọtun).Pẹpẹ iwọn = 20 µm.d Aṣoju awọn aworan microscopic ti BF droplet fusion of αS/pLK (molar ratio 1:10) ni ifọkansi ti 25 μM;awọn itọka tọka si idapọ ti awọn sisọ kọọkan (awọn ọfa pupa ati ofeefee) sinu isọ silẹ tuntun (ọfa osan) laarin 200 ms) .Pẹpẹ iwọn = 20 µm.e Itupa ina (ni 350 nm) αS / pLK akopọ ni ifipamọ LLPS ṣaaju ati lẹhin afikun ti 500 mM NaCl tabi 10% 1,6-HD ni 25 µM αS (N = 3 awọn atunwi apẹẹrẹ, tumọ ati iyapa boṣewa tun tọka).f BF aworan (oke) ati itupale itọka ina (ni 350 nm, isalẹ) ti αS / pLK aggregation ni 25 μM αS pẹlu jijẹ αS: pLK molar ratio (N = 3 sample replicates, mean and standard deviation also itọkasi).Pẹpẹ iwọn = 10 µm.Pẹpẹ iwọn lori aworan kan tọkasi iwọn gbogbo awọn aworan ninu nronu kan.A pese data aise ni irisi awọn faili data aise.
Da lori awọn akiyesi wa ti αS/pLK electrostatic eka condensation ati awọn akiyesi ti tẹlẹ ti αS gẹgẹbi ohun elo alabara ti tau/RNA condensate nipasẹ ibaraenisepo taara pẹlu tau31, a pinnu pe αS ati tau le ṣepọ pẹlu epo ni aini RNA condensation.nipasẹ awọn eka elekitirotatiki, ati αS jẹ amuaradagba scaffold ni αS/Tau coacervates (wo pinpin idiyele tau ni Nọmba 2e).A ṣe akiyesi pe nigbati 10 μM αS ati 10 μM Tau441 (ti o ni 1 μM AF488-αS ati 1 μM Atto647N-Tau, ni atele) ni a dapọ papo ni ifipamọ LLPS, wọn ni irọrun ṣẹda awọn akopọ amuaradagba ti o ni awọn ọlọjẹ mejeeji, bi a ti rii nipasẹ ohun airi WF.(Eya. 2a).Iṣọkan ti awọn ọlọjẹ meji ti o wa ninu awọn droplets ni a ti fi idi rẹ mulẹ nipasẹ confocal (CF) microscopy (Afikun 1a).Iru ihuwasi kanna ni a ṣe akiyesi nigba ti a lo dextran-70 bi oluranlowo apapọ (Afikun 1c).Lilo boya FITC ti o ni aami PEG tabi dextran, a rii pe awọn aṣoju apejọ mejeeji ni a pin ni deede kọja awọn apẹẹrẹ, ko ṣe afihan ipinya tabi ajọṣepọ (Eya afikun. 1d).Dipo, o ni imọran pe ninu eto yii wọn ṣe agbega ipinya alakoso nipasẹ awọn ipa ikojọpọ macromolecular, niwọn bi PEG jẹ aṣoju apejọ iduroṣinṣin ni yiyan, bi a ti rii ninu awọn eto LLP miiran33,34.Awọn droplets ọlọrọ-amuaradagba wọnyi jẹ ifarabalẹ si NaCl (1 M) ṣugbọn kii ṣe si 1,6-HD (10% v / v), ti o jẹrisi awọn ohun-ini elekitirosi wọn (Eya afikun 2a, b).Iwa ito wọn jẹ timo nipasẹ wiwo awọn iṣẹlẹ isọpọpọ awọn iṣẹju-aaya nipa lilo microscopy BF (Fig. 2b).
a Confocal (CF) awọn aworan microscopy ti αS/Tau441 coacervates ni ifipamọ LLPS (10 μM ti amuaradagba kọọkan, 0.5 μM ti AF488-aami αS ati Atto647N-aami Tau441).b Aṣoju iyatọ kikọlu iyatọ iyatọ (DIC) awọn aworan ti awọn iṣẹlẹ αS/Tau441 droplet fusion (10 μM fun amuaradagba kọọkan).c aworan atọka ti o da lori itọka ina (ni 350 nm) ti Tau441 LLPS (0-15 µM) ni isansa (osi) tabi wiwa (ọtun) ti 50 µM αS.Awọn awọ igbona tọkasi diẹ sii tituka.d Itupa ina ti awọn ayẹwo αS/Tau441 LLPS pẹlu jijẹ ifọkansi αS (Tau441 ni 5 µM, N = 2-3 awọn atunwi ayẹwo bi a ti tọka si).e Aṣoju sikematiki ti diẹ ninu awọn iyatọ amuaradagba tau ati awọn agbegbe oriṣiriṣi ti amuaradagba ti a lo ninu iwadii yii: ti ko ni idiyele N-terminal domain (pupa), agbegbe ọlọrọ-ọlọrọ (bulu), agbegbe-binding microtubule (MTBD, afihan ni osan), ati amyloid-parapo ajija.Awọn agbegbe filamenti (PHF) ti o wa laarin MTBD (grẹy).Maapu Net Charge Per Residue (NCPR) ti Tau441 ti han.f Lilo 1 µM AF488-aami αS ati Atto647N-aami ΔNt-, ni lilo 1 µM AF488-aami αS tabi ΔCt-αS ni iwaju ΔNt-Tau (oke, 10 µM fun amuaradagba) tabi K18 (isalẹ, 5M fun amuaradagba) ))) awọn micrographs ti WF ti di ni LLPS tabi ifipamọ K18.Awọn ifi iwọn ni aworan kan ṣe aṣoju iwọn ti gbogbo awọn aworan ninu panẹli kan (20µm fun awọn panẹli a, b ati f).Awọn data aise fun awọn panẹli c ati d ni a pese bi awọn faili data aise.
Lati ṣe idanwo ipa ti αS ninu ilana LLPS yii, a kọkọ ṣe iwadii ipa ti αS lori iduroṣinṣin droplet nipasẹ nephelometry nipa lilo awọn ifọkansi ti o pọ si ti NaCl (Fig. 2c).Idojukọ iyọ ti o ga julọ ninu awọn ayẹwo ti o ni αS, ga julọ awọn iye itọka ina (ni 350 nm), eyiti o tọka ipa iduroṣinṣin ti αS ninu eto LLPS yii.Ipa ti o jọra ni a le ṣe akiyesi nipasẹ jijẹ ifọkansi αS (ati nitorinaa αS: ipin Tau441) si isunmọ.10-agbo ilosoke ojulumo si awọn tau fojusi (5 µM) (Fig. 2d).Lati ṣe afihan pe αS jẹ amuaradagba scaffold ni awọn coacervates, a pinnu lati ṣe iwadii ihuwasi ti LLPS-disrupted Tau mutant, eyiti ko ni idiyele ti ko tọ si agbegbe N-terminal (awọn iyokù 1-150, wo Fig. 2e) ti a pe ni ΔNt-Tau.WF microscopy ati nephelometry jẹrisi pe ΔNt-Tau funrararẹ ko faragba LLPS (Fig. 2f ati Apọju 2d), gẹgẹ bi a ti royin tẹlẹ 14. Sibẹsibẹ, nigbati a ṣafikun αS si awọn ojutu pipinka ti iyatọ Tau truncated yii, ilana LLPS jẹ patapata. ti a tun pada pẹlu iwuwo droplet isunmọ si iwuwo droplet ti awọn ipinnu iwọn kikun ti Tau ati αS labẹ awọn ipo ti o jọra ati awọn ifọkansi amuaradagba.Ilana yi le tun ti wa ni šakiyesi labẹ awọn ipo ti kekere macromolecular crowding (Afikun Ọpọtọ. 2c).Ipa ti agbegbe C-terminal αS, ṣugbọn kii ṣe gbogbo ipari rẹ, ninu ilana LLPS ni a ṣe afihan nipasẹ idinamọ ti iṣelọpọ droplet nipa lilo iyatọ C-terminal truncated αS iyatọ aini awọn iṣẹku 104-140 (Fig. 1a) ti (ΔCt- αS) amuaradagba (Fig. 2f ati Àfikún Ọpọtọ. 2d).Iṣọkan ti αS ati ΔNt-Tau ni a fi idi rẹ mulẹ nipasẹ microscopy fluorescence confocal (Afikun Ọpọtọ. 1b).
Lati ṣe idanwo siwaju si ẹrọ LLPS laarin Tau441 ati αS, a lo iyatọ Tau afikun, eyun ajẹkù helical filament core (PHF) ti a so pọ ni agbegbe microtubule-binding (MTBD), eyiti o ba ni awọn ibugbe atunwi abuda mẹrin, ti o tun mọ ni gbogbogbo bi ajẹkù K18 (wo olusin 2e).Laipẹ o ti royin pe αS ni pataki sopọ mọ amuaradagba tau kan ti o wa ni agbegbe ọlọrọ proline ni ọkọọkan ti o ṣaju agbegbe-abuda microtubule.Sibẹsibẹ, agbegbe PHF tun jẹ ọlọrọ ni awọn iṣẹku ti o daadaa (wo Nọmba 2e), paapaa lysine (awọn iyokù 15%), eyiti o jẹ ki a ṣe idanwo boya agbegbe yii tun ṣe alabapin si ifunmọ ti eka αS / Tau.A ṣe akiyesi pe K18 nikan ko le ṣe okunfa LLPS ni awọn ifọkansi to 100 μM labẹ awọn ipo ti a ṣe idanwo (ṣafipamọ LLPS pẹlu 15% PEG tabi 20% dextran) (Figure 2f).Bibẹẹkọ, nigba ti a ṣafikun 50 µM αS si 50 µM K18, iṣelọpọ iyara ti awọn droplets amuaradagba ti o ni K18 ati αS ni a ṣe akiyesi nipasẹ nephelometry (Afikun Fikun. 2d) ati microscopy WF (Fig. 2f).Gẹgẹbi a ti ṣe yẹ, ΔCt-αS ko lagbara lati mu pada ihuwasi LLPS ti K18 (Fig. 2f).A ṣe akiyesi pe apapọ αS/K18 nilo awọn ifọkansi amuaradagba ti o ga diẹ lati fa LLPS ni akawe si αS/ΔNt-Tau tabi αS/Tau441, awọn nkan miiran jẹ dogba.Eyi ni ibamu pẹlu ibaraenisepo ti o lagbara ti agbegbe αS C-terminal pẹlu proline-rich Tau domain akawe si agbegbe-binding microtubule, bi a ti ṣalaye tẹlẹ 31.
Ni fifunni pe ΔNt-Tau ko le ṣe LLPS ni isansa ti αS, a yan iyatọ Tau yii gẹgẹbi awoṣe fun sisọ αS/Tau LLPS ti a fun ni ayedero rẹ ni awọn eto LLPS pẹlu Tau gigun ni kikun (isotype, Tau441/Tau441).pẹlu eka (heterotypic, αS/Tau441) awọn ilana ikojọpọ.A ṣe afiwe iwọn ti apapọ αS (gẹgẹbi apakan ti amuaradagba alakoso ti di, fαS,c) ninu awọn eto αS/Tau ati αS/ΔNt-Tau nipasẹ centrifugation ati pipinka alakoso SDS-PAGE onínọmbà (wo 2e), rii awọn iye ti o jọra pupọ. fun gbogbo awọn ọlọjẹ ni ifọkansi kanna.Ni pato, a gba fαS, c 84 ± 2% ati 79 ± 7% fun αS / Tau ati αS / ΔNt-Tau, lẹsẹsẹ, ni iyanju pe ibaraenisepo heterotypic laarin αS ati tau ga ju ibaraenisepo laarin awọn ohun elo tau.laarin.
Ibaraṣepọ pẹlu ọpọlọpọ awọn polycations ati ipa ti ilana isọdọkan lori awọn kinetics αS ni a kọkọ ṣe ikẹkọ nipasẹ imularada fluorescence lẹhin ọna fọtobleaching (FRAP).A ṣe idanwo αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau ati αS/pLK coacervates (100 μM αS ni afikun pẹlu 2 μM αS AF488-αS ati 100 μM Tau441 tabi ΔNt-Tau tabi 1 mM pLK).A gba data laarin awọn iṣẹju 30 akọkọ lẹhin ti o dapọ awọn paati ayẹwo.Lati awọn aworan FRAP asoju (Fig. 3a, αS / Tau441 condensation) ati awọn akoko ipari akoko ti o baamu wọn (Fig. 3b, Fikun Apọju. 3), o le rii pe αS kinetics jẹ iru pupọ si awọn ti Tau441 coacervates.ati ΔNt-Tau, eyiti o yara pupọ pẹlu pLK.Awọn iṣiro itọka kaakiri fun αS inu coacervate ni ibamu si FRAP (gẹgẹbi a ti ṣalaye nipasẹ Kang et al. 35) jẹ D = 0.013 ± 0.009 µm2/s ati D = 0.026 ± 0.008 µm2/s fun αS/Tau441 ati αS/Tau441 αS / eto.pLK, Tau, ati D = 0.18 ± 0.04 µm2/s, lẹsẹsẹ (Fig. 3c).Bibẹẹkọ, olùsọdipúpọ αS ti kaakiri ni ipele pipinka jẹ awọn aṣẹ titobi pupọ ti o ga ju gbogbo awọn ipele ti o ni dipọ, gẹgẹ bi a ti pinnu nipasẹ Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS, wo Apejuwe Apọju. ( D = 8 ± 4 µm2/s).Nitorinaa, awọn kinetics ti itumọ αS ti dinku ni pataki ni awọn coacervates ni akawe si awọn ọlọjẹ ni ipele pipinka nitori awọn ipa ikojọpọ molikula ti o sọ, botilẹjẹpe gbogbo awọn coacervates ṣe idaduro awọn ohun-ini olomi-bi ni idaji wakati akọkọ lẹhin iṣelọpọ wọn, ni idakeji si ipele tau.yiyara kinetics ni pLK condensate.
A–c FRAP igbekale ti αS dainamiki (2% AF488-aami αS) ni electrostatic coacervates.Awọn aworan aṣoju ti awọn ayẹwo αS/Tau441 FRAP ni ẹẹmẹta ni a fihan ni (a), nibiti awọn iyika pupa ṣe tọka si awọn agbegbe ti ko ni awọ.Pẹpẹ iwọn jẹ 5 µm.b Awọn iyipo FRAP aropin ati (c) awọn iṣiro itọka kaakiri (D) fun 5-6 (N) awọn isunmi oriṣiriṣi lati awọn adanwo mẹta nipa lilo 100 µM αS ati awọn ifọkansi equimolar ti Tau441 (pupa) tabi ΔNt-Tau (bulu) tabi pLK (alawọ ewe) ni igba mẹwa ifọkansi ti LLPS.Iyapa boṣewa ti ọna FRAP ti han ni awọ iboji.Fun ifiwera, olùsọdipúpọ αS ni ipele pipinka ni a pinnu ni ẹẹmẹta nipa lilo spectroscopy correlation fluorescence (FCS) (wo Aworan Afikun 3 ati awọn ọna fun alaye diẹ sii).d Ilọsiwaju X-band EPR spectra ti 100 μM TEMPOL-122-αS ni ifipamọ LLPS laisi eyikeyi polycation (dudu) tabi niwaju 100 μM Tau441 (pupa) tabi ΔNt-Tau (bulu) tabi 1 mM pLK (alawọ ewe).Awọn inset fihan wiwo ti o ga ti awọn laini aaye ti o lagbara nibiti awọn ayipada iyalẹnu julọ waye.e Binding ekoro ti 50 μM TEMPOL-122-αS pẹlu orisirisi polycations ni awọn isansa ti LLPS (ko si PEG).Iwọn titobi ti ẹgbẹ III ti o dinku ni akawe si ẹgbẹ II (IIII/III) ti iwoye EPR deede jẹ afihan lati mu awọn ipin molar ti Tau441 (pupa), ΔNt-Tau (buluu) ati pLK (alawọ ewe).Awọ ila fihan fit to data nipa lilo a ti o ni inira abuda awoṣe pẹlu n aami ati ominira abuda ojula lori kọọkan ti tẹ.A pese data aise ni irisi awọn faili data aise.
Gẹgẹbi ibaramu, a ṣe iwadii awọn agbara ti αS ni ọpọlọpọ awọn coacervates nipa lilo aami isamisi ti a darí (SDSL) ati isọdọtun paramagnetic elekitironi ti nlọ lọwọ (CW-EPR).Ọna yii ti fihan pe o wulo pupọ ni jijabọ irọrun ati awọn ipadaki ti IDP pẹlu ipinnu ti o ku ojulowo36,37,38.Ni ipari yii, a ṣe awọn iṣẹku cysteine ​​ni awọn ẹda Cys ẹyọkan ati lo 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl (TEMPOL).Awọn itọsẹ Maleimide ṣe aami wọn.Ni pataki diẹ sii, a fi sii awọn iwadii TEMPOL ni ipo 122 tabi 24 αS (TEMPOL-122-αS ati TEMPOL-24-αS).Ninu ọran akọkọ, a fojusi agbegbe C-terminal ti amuaradagba, eyiti o ni ipa ninu ibaraenisepo pẹlu awọn polycations.Dipo, ipo 24 le fun wa ni alaye nipa awọn ipa-ọna gbogbogbo ti awọn ọlọjẹ ni condensate.Ni awọn ọran mejeeji, awọn ifihan agbara EPR ti a gba fun awọn ọlọjẹ ti ipele ti a tuka ni ibamu si awọn radicals nitroxide ni ipo gbigbe ni iyara.Lẹhin ipinya alakoso ni iwaju tau tabi pLK (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 tabi ΔNt-Tau ni ipin kan ti 1: 1 tabi pLK ni ipin kan ti 1: 10), ilosoke ninu kikankikan tente oke ibatan ni a ṣe akiyesi ni irisi EPR ti αS.Laini ipadanu gbooro, nfihan idinku αS reorientation kinetics ni awọn droplets ni akawe si amuaradagba ni ipele dilute (Ọpọtọ. 3d, Aworan Afikun. 4a).Awọn iyipada wọnyi jẹ diẹ sii ni alaye ni ipo 122. Lakoko ti o wa ni ipo 24 ifarahan pLK ko ni ipa lori awọn kinetics ti iwadi naa, ni ipo 122 apẹrẹ ila ila-ara ti yipada ni pataki (Afikun 4a).Nigba ti a ba gbiyanju lati ṣe apẹẹrẹ sipekitira ni ipo 122 ti awọn ọna ṣiṣe αS/polication meji nipa lilo awoṣe isotropic (Afikun Nọmba 5a) ti a nlo nigbagbogbo lati ṣe apejuwe awọn agbara ti IDP38,39 ti a fi aami-apapọ, a ko lagbara lati ṣe atunṣe iwoye esiperimenta..Spectral kikopa ti awọn ipo ti 24 spins contrasts (Afikun Ọpọtọ. 5a).Eyi ni imọran pe awọn ipo yiyan wa ni aaye ti awọn atunto iyipo ti agbegbe C-terminal ti αS ni iwaju awọn polycations.Nigbati o ba ṣe akiyesi ida ti αS ni ipele ti dipọ labẹ awọn ipo idanwo EPR (84 ± 2%, 79 ± 7%, ati 47 ± 4% fun αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau, ati αS/pLK, lẹsẹsẹ — wo Afikun Aworan 2e ti itupalẹ data c), o le rii pe ifọrọhan ti a rii nipasẹ ọna EPR ni akọkọ ṣe afihan ibaraenisepo ti agbegbe C-terminal ti αS pẹlu ọpọlọpọ awọn polycations ni ipele ti di di (iyipada akọkọ nigba lilo TEMPOL-122- αS), kii ṣe isunmọ amuaradagba.Ilọsi microviscosity ni a ṣe akiyesi ninu iwadii naa.Gẹgẹbi a ti ṣe yẹ, irisi EPR ti amuaradagba labẹ awọn ipo miiran yatọ si LLPS ni a mu pada patapata nigbati 1 M NaCl ti fi kun si adalu (Eya afikun. 4b).Lapapọ, data wa daba pe awọn iyipada ti a rii nipasẹ CW-EPR ni akọkọ ṣe afihan ibaraenisepo ti agbegbe C-terminal ti αS pẹlu ọpọlọpọ awọn polycations ni ipele ti dipọ, ati pe ibaraenisepo yii dabi pe o lagbara pẹlu pLK ju pẹlu Tau.
Lati le gba alaye igbekale diẹ sii nipa awọn ọlọjẹ ninu coacervate, a pinnu lati kawe eto LLPS nipa lilo NMR ni ojutu.Bibẹẹkọ, a le rii ida αS nikan ti o ku ni ipele ti tuka, eyiti o le jẹ nitori awọn agbara amuaradagba ti o dinku ninu coacervate ati ipo ipon ni isalẹ ojutu ni itupalẹ NMR.Nigba ti a ba ṣe atupale ọna ati awọn agbara ti amuaradagba ti o ku ni ipele pipinka ti ayẹwo LLPS nipa lilo NMR (Afikun Ọpọtọ. 5c, d), a ṣe akiyesi pe amuaradagba huwa ni deede ni iwaju pLK ati ΔNt-Tau, mejeeji ti eyi ti o wa ni eto-atẹle ati awọn agbara ti ẹhin amuaradagba, ti a fihan nipasẹ awọn adanwo lori iyipada kemikali keji ati isinmi R1ρ.Awọn data NMR fihan pe C-terminus ti αS jiya ipadanu nla ti irọrun conformational lakoko ti o ni idaduro iseda rudurudu rẹ, bii iyoku ti ilana amuaradagba, nitori awọn ibaraenisepo rẹ pẹlu awọn polycations.
Niwọn igba ti ifihan ifihan CW-EPR ti n gbooro ti a ṣe akiyesi ni TEMPOL-122-αS apakan isunmọ ṣe afihan ibaraenisepo ti amuaradagba pẹlu awọn polycations, a ṣe titration EPR kan lati ṣe iṣiro isọdọkan abuda ti αS si ọpọlọpọ awọn polycations ni isansa ti LLPS (ko si ikojọpọ ti Buffer LLPS), ni iyanju pe awọn ibaraenisepo jẹ kanna ni dilute ati awọn ipele ifọkansi (eyiti a fi idi rẹ mulẹ nipasẹ data wa, Apọju Apọju. 4a ati Aworan Apọju. 6).Ibi-afẹde naa ni lati rii boya gbogbo awọn coacervates, laibikita awọn ohun-ini ti omi ti o wọpọ, ṣe afihan eyikeyi ihuwasi iyatọ ti o wa ni ipilẹ ni ipele molikula.Gẹgẹbi a ti ṣe yẹ, iwoye EPR ti gbooro pẹlu ifọkansi polycation ti o pọ si, ti n ṣe afihan idinku ninu irọrun molikula nitori awọn ibaraenisepo molikula ti gbogbo awọn alabaṣepọ ibaraenisepo ti o fẹrẹ si itẹlọrun (Fig. 3e, Aworan Afikun. 6).pLK ṣaṣeyọri itẹlọrun yii ni ipin molar kekere (polycation: αS) ni akawe si ΔNt-Tau ati Tau441.Ni otitọ, lafiwe ti data naa pẹlu awoṣe isunmọ isunmọ ti o ro pe n aami ati awọn aaye isọdọmọ ominira fihan pe igbagbogbo iyapa ti pLK (~ 5 μM) jẹ aṣẹ titobi ti o kere ju ti Tau441 tabi ΔNt-Tau (~ 50 μM) ).µM).Botilẹjẹpe eyi jẹ iṣiro ti o ni inira, eyi daba pe αS ni ibatan ti o ga julọ fun awọn polycations ti o rọrun pẹlu awọn agbegbe idiyele rere ilọsiwaju.Fi fun iyatọ yii ni isunmọ laarin αS ati ọpọlọpọ awọn polycations, a pinnu pe awọn ohun-ini omi wọn le yipada ni oriṣiriṣi lori akoko ati nitorinaa jiya lati oriṣiriṣi awọn ilana LSPT.
Fi fun agbegbe ti o kun pupọ laarin amuaradagba coacervate ati iseda amyloid ti amuaradagba, a ṣe akiyesi ihuwasi ti coacervate ni akoko pupọ lati rii awọn ilana LSPT ti o ṣeeṣe.Lilo BF ati microscopy CF (Nọmba 4), a ṣe akiyesi pe αS / Tau441 coacervates si iwọn nla ni ojutu, ti o ṣẹda awọn droplets nla ti o kan si ati ki o tutu dada ni isalẹ ti daradara / ifaworanhan bi awọn droplets ni kikun, bi o ti ṣe yẹ (Ọpọtọ Afikun .7d);a pe awọn ẹya ti o wa ni isalẹ-isalẹ “awọn rafts amuaradagba”.Awọn ẹya wọnyi wa ni ito bi wọn ṣe ni agbara lati dapọ (Ọpọtọ Iyọnda. 7b) ati pe a le rii fun awọn wakati pupọ lẹhin ti LLPS ti fa (Fig. 4 ati Apọju 7c).A ṣe akiyesi pe ilana idọti jẹ ojurere lori oju omi hydrophilic dipo awọn ohun elo hydrophobic (Afikun Fig. 7a), bi a ti ṣe yẹ fun awọn coacervates electrostatic pẹlu awọn idiyele ti ko ni iwọntunwọnsi ati nitorinaa awọn agbara dada elekitirostatic giga.Ni pataki, αS/ΔNt-Tau coalescence ati rafting ti dinku ni pataki, lakoko ti awọn condensates αS/pLK ti dinku pupọ (Fig. 4).Ni akoko igbaduro kukuru, awọn droplets αS / pLK ni anfani lati ṣajọpọ ati ki o tutu oju omi hydrophilic, ṣugbọn ilana yii ni kiakia duro ati lẹhin awọn wakati 5 ti iṣipopada, awọn iṣẹlẹ ifọkanbalẹ ti o ni opin nikan ko si si ririn.– jeli-drip orilede.
Aṣoju BF (awọn panẹli greyscale) ati CF (awọn panẹli ọtun, AF488-aami αS ni alawọ ewe) ti awọn ayẹwo coacervate ti o ni 100 µM αS (aami fluorescent 1%) ni ifipamọ LLPS ni iwaju 100 µM Tau441 (oke) awọn aworan micropict. -Tau (aarin) tabi 1 mM pLK (isalẹ) ni orisirisi awọn akoko idabo ati awọn ibi giga (z, ijinna lati isalẹ ti daradara awo).Awọn idanwo naa tun ni awọn akoko 4-6 ni ominira ti ara wọn pẹlu awọn abajade kanna.αS/Tau441 coacervates ti wa ni tutu lẹhin awọn wakati 24, ti o n ṣe awọn rafts ti o tobi ju aworan naa lọ.Pẹpẹ iwọn fun gbogbo awọn aworan jẹ 20 µm.
Lẹhinna a beere boya awọn adagun-omi amuaradagba ti omi nla ti o ṣẹda ni αS/Tau441 LLPS yoo yorisi amyloid aggregation ti eyikeyi awọn ọlọjẹ ti a ṣe iwadi.A tẹle awọn maturation ti αS / Tau441 droplets lori akoko pẹlu WF microscopy labẹ awọn ipo kanna bi loke, ṣugbọn lilo 1 μM AF488-aami αS ati Atto647N-aami Tau441 (Fig. 5a).Gẹgẹbi a ti ṣe yẹ, a ṣe akiyesi agbegbe amuaradagba pipe jakejado ilana maturation.O yanilenu, lati ca.Lẹhin awọn wakati 5, diẹ sii awọn ẹya ti kii ṣe ipin ti o ni agbara ni a ṣe akiyesi inu awọn rafts, eyiti a pe ni “awọn aaye”, diẹ ninu eyiti a ti ṣajọpọ pẹlu αS, ati diẹ ninu awọn ti ni idarato ni Tau441 (Fig. 5a, awọn ọfa funfun).Awọn aaye wọnyi ni a ti ṣe akiyesi nigbagbogbo laarin awọn rafts si iwọn nla fun αS/ΔNt-Tau ju fun αS/ΔNt-Tau.Ko si awọn aaye ọtọtọ ninu awọn droplets ti pLK ati awọn ọna ṣiṣe Tau ti ko ni agbara fun idapọ / rirọ.Lati ṣe idanwo boya awọn abawọn wọnyi ti o ni αS ati Tau441 jẹ amyloid-like aggregates, a ṣe iru idanwo kan nipa lilo microscopy CF ninu eyiti Tau441 ti jẹ aami pẹlu Atto647N ati 12.5 μM amyloid-specific thioflavin-T (ThT) ni a ṣafikun lati ibẹrẹ.àwọ̀.Bi o ti jẹ pe ThT-abariwon ti αS / Tau441 droplets tabi rafts ko ṣe akiyesi paapaa lẹhin 24 h ti idabobo (Fig. 5b, oke ila-awọn droplets ti o ku lori awọn rafts amuaradagba), awọn ẹya-ara ThT-positive ti o ni Atto647N-Tau441 ninu awọn rafts jẹ ailera pupọ.eyi ṣe atunṣe iwọn, apẹrẹ, ati ipo ti awọn aaye ti a ti ṣapejuwe tẹlẹ (Fig. 5b, awọn ori ila aarin ati isalẹ), ni iyanju pe awọn aaye naa le ṣe deede si awọn akojọpọ amyloid-like ti a ṣe ni awọn iṣọn omi ti ogbo.
WF 25 μM αS ni ọpọlọpọ awọn akoko idabo ati awọn ibi idojukọ (z, ijinna lati isalẹ ti a ko tii) ni iwaju 25 μM Tau441 (1 μM AF488-aami αS ati Atto647N-aami Tau441) ni daradara ti awo microscope kan pẹlu ifipamọ LLPS) .Awọn adanwo mẹfa ni a tun ṣe ni ominira pẹlu awọn abajade kanna.b CF aworan microscopic ti 25 μM αS ni iwaju 25 μM Tau441 (1 μM Atto647N-aami Tau441) ati 12.5 μM thioflavin-T (ThT).Awọn droplets amuaradagba iwuwo ati awọn raft amuaradagba ti a fi silẹ ati awọn aaye han ni oke ati awọn ori ila aarin, lẹsẹsẹ.Laini isalẹ fihan awọn aworan ti awọn rafts ati silė lati awọn ẹda ominira 3.Awọn itọka funfun tọkasi awọn aami-rere ThT ninu awọn panẹli mejeeji.Pẹpẹ iwọn fun gbogbo awọn aworan jẹ 20 µm.
Lati ṣe ayẹwo ni awọn alaye diẹ sii awọn iyipada ninu nẹtiwọọki amuaradagba coacervate lakoko iyipada lati omi si ri to, a lo aworan igbesi aye fluorescence (FLIM) ati Förster resonance energy transfer microscopy (FRET) (Nọmba 6 ati Awọn eeya Afikun 8 ati 9).A nireti pe idagbasoke coacervate ti Layer sinu isọdi diẹ sii tabi paapaa ilana amuaradagba ti o ni agbara-bii ti o yori si isunmọ isunmọ laarin amuaradagba ati iwadii Fuluorisenti ti o somọ, ti o le mu ipa ipaniyan kan han ni igbesi aye iwadii kukuru (τ) , bi a ti ṣalaye tẹlẹ 40.,41,42.Ni afikun, fun awọn ayẹwo aami ilọpo meji (AF488 ati Atto647N bi oluranlọwọ FRET ati awọn awọ gbigba, ni atele), idinku yii ni τ tun le wa pẹlu ifunmọ coacervate ati ilosoke ninu ṣiṣe FRET (E) lakoko LSPT.A ṣe abojuto raft ati idasile aaye ni akoko pupọ ni LLPS αS/Tau441 ati αS/ΔNt-Tau awọn ayẹwo (25 µM ti amuaradagba kọọkan ninu ifipamọ LLPS ti o ni 1 µM AF488 ti o ni aami αS ati/tabi Atto647N ti a pe ni Tau441 tabi ΔNt-Tau).A ṣe akiyesi aṣa gbogbogbo ni pe igbesi aye fluorescence ti AF488 (τ488) ati Atto647N (τ647N) awọn iwadii ti dinku diẹ bi awọn coacervates ti dagba (Fig. 6 ati Apọju 8c).O yanilenu, iyipada yii ni ilọsiwaju pupọ fun awọn aami laarin awọn rafts (Fig. 6c), ti o nfihan pe imudara amuaradagba siwaju sii waye ni awọn aami.Ni atilẹyin eyi, ko si iyipada pataki ni igbesi aye fluorescence fun αS / ΔNt-Tau droplets ti o wa fun 24 h (Afikun Fikun. 8d), ni iyanju pe gelation droplet jẹ ilana ti o yatọ si iranran ati pe ko ṣe atẹle pẹlu isọdọtun molikula pataki. laarin coacervates.O yẹ ki o ṣe akiyesi pe awọn aami ni awọn titobi oriṣiriṣi ati akoonu iyipada ni αS, paapaa fun eto αS / Tau441 (Afikun 8e).Idinku ni igbesi aye fluorescence iranran pẹlu ilosoke ninu kikankikan, ni pataki fun Atto647N ti a samisi Tau441 (Afikun Aworan 8a), ati awọn ṣiṣe FRET ti o ga julọ fun awọn eto αS/Tau441 ati αS/ΔNt-Tau, ti o nfihan ifọkanbalẹ siwaju ni awọn wakati marun LLPS lẹhin ti nfa, awọn ọlọjẹ inu ina aimi ti di.Ti a ṣe afiwe si αS/ΔNt-Tau, a ṣe akiyesi τ647N kekere ati diẹ ninu awọn iye τ488 ti o ga julọ ni awọn aaye αS/Tau441, ti o tẹle pẹlu kekere ati awọn iye FRET inhomogeneous diẹ sii.O ṣee ṣe, eyi le ni ibatan si otitọ pe ninu eto αS / Tau441, ti a ṣe akiyesi ati ti o nireti αS opo ni awọn akojọpọ jẹ diẹ sii orisirisi, nigbagbogbo substoichiometric akawe si Tau, niwon Tau441 funrararẹ le tun faragba LLPS ati aggregation (Afikun Fig. 8e) .Bibẹẹkọ, iwọn isọdọkan droplet, idasile raft, ati, ni pataki, ikojọpọ amuaradagba laarin awọn coacervates omi-bi o pọju nigbati mejeeji Tau441 ati αS wa.
Awọn aworan microscopy fluorescence kan ti igbesi aye (FLIM) ti αS/Tau441 ati αS/ΔNt-Tau ni 25 μM ti amuaradagba kọọkan (1 μM AF488-aami αS ati 1 μM Atto647N-aami Tau441 tabi ΔNt-Tau) ni LL.Awọn ọwọn naa ṣe afihan awọn aworan aṣoju ti awọn ayẹwo LLPS ni awọn akoko maturation oriṣiriṣi (iṣẹju 30, wakati 5 ati awọn wakati 24).Freemu pupa fihan agbegbe ti o ni awọn aaye αS/Tau441 ninu.Awọn akoko igbesi aye han bi awọn ifi awọ.Pẹpẹ iwọn = 20 µm fun gbogbo awọn aworan.b Aworan FLIM ti o sun-un ti agbegbe ti o yan, ti o han ninu apoti pupa ni nronu a.Awọn sakani igbesi aye han ni lilo iwọn awọ kanna bi ninu nronu a.Pẹpẹ iwọn = 5 µm.c Histograms ti o nfihan AF488 (so si αS) tabi Atto647N (ti o somọ si Tau) fun oriṣiriṣi awọn ẹya amuaradagba (Droplets-D-, raft-R- and speckle-P) ti a mọ ni awọn aworan FLIM ti o gbasilẹ fun αS-) awọn pinpin akoko igbesi aye Tau441 ati αS/ΔNt-Tau awọn ayẹwo coacervate (N = 17-32 ROI fun D, ​​29-44 ROI fun R, ati 21-51 ROI fun awọn aaye).Itumọ ati awọn iye agbedemeji jẹ afihan bi awọn onigun mẹrin ofeefee ati awọn laini dudu inu awọn apoti, ni atele.Awọn opin isalẹ ati oke ti apoti naa ṣe aṣoju awọn ipele akọkọ ati kẹta, ni atele, ati pe o kere julọ ati awọn iye ti o pọju laarin 1.5-fold interquartile (IQR) ni a fihan bi awọn whiskers.Outliers han bi awọn okuta iyebiye dudu.Pataki iṣiro laarin awọn orisii pinpin ni ipinnu nipa lilo idanwo t-meji kan, ti a ro pe awọn iyatọ ti ko dọgba.Awọn iye p-idanwo t-meji ni a fihan pẹlu awọn ami akiyesi fun bata kọọkan ti data akawe (* p-iye> 0.01, ** p-iye> 0.001, *** p-iye> 0.0001, **** p-iye> 0.00001), ns Tọkasi aifiyesi (p-iye> 0.05).Awọn iye p gangan ni a fun ni Tabili 1 Afikun, ati pe data atilẹba ni a gbekalẹ bi awọn faili data aise.
Lati ṣe afihan siwaju sii iru amyloid-like ti awọn speckles / aggregates, a ṣe itọju awọn ayẹwo coacervate ti ko ni abawọn fun awọn wakati 24 pẹlu awọn ifọkansi giga ti (1 M) NaCl, eyiti o yorisi ipinya awọn akojọpọ lati awọn coacervates amuaradagba.Nigbati awọn akojọpọ ti o ya sọtọ (ie, ojutu ti a tuka ti awọn akojọpọ) ni a ṣe akiyesi nipa lilo microscopy agbara atomiki (AFM), a ṣe akiyesi morphology ti iyipo pupọ julọ pẹlu giga deede ti iwọn 15 nm, eyiti o duro lati ṣepọ labẹ awọn ipo ti ifọkansi iyọ giga, iru si ihuwasi ti awọn fibrils amyloid aṣoju nitori ipa hydrophobic ti o lagbara lori dada (akiyesi pe awọn fibrils ni igbagbogbo ni giga ti ~ 10 nm) (Eya afikun. 10a).O yanilenu, nigba ti awọn akojọpọ ti o ya sọtọ ti wa ni idawọle pẹlu ThT ni iṣiro ThT fluorescence ti o ṣe deede, a ṣe akiyesi ilosoke ti o pọju ni ThT fluorescence quantum ikore, ti o ṣe afiwe si eyi ti a ṣe akiyesi nigba ti a fi awọ ṣe pẹlu awọn fibrils amyloid αS aṣoju (Afikun Fig. 10b), ni iyanju pe awọn akojọpọ coacervate ni awọn ẹya amyloid-bi..Ni otitọ, awọn akojọpọ jẹ ifarada si awọn ifọkansi iyọ ti o ga ṣugbọn o ni imọran si 4 M guanidine chloride (GdnHCl), gẹgẹbi awọn fibrils amyloid aṣoju (Afikun Fig. 10c).
Nigbamii ti, a ṣe atupale akojọpọ awọn akojọpọ nipa lilo fluorescence molecule kanṣoṣo, ibaramu fluorescence kan pato / spectroscopy correlation-cross-correlation (FCS/FCCS), ati igbekale ti nwaye ti wiwa ijamba-meji awọ (TCCD).Ni ipari yii, a ṣe awọn akojọpọ ti o ya sọtọ lẹhin awọn wakati 24 ti isubu ni awọn ayẹwo 100 μl LLPS ti o ni αS ati Tau441 (mejeeji 25 μM) papọ pẹlu 1 μM AF488-aami αS ati 1 μM Atto647N-aami Tau441.Di ojutu apapọ ti o ti tuka si ipo monomolecular kan ni lilo ifipamọ ọfẹ PEG kanna ati 1 M NaCl (ipamọ kanna ti a lo lati ya awọn akojọpọ kuro lati coacervate) lati ṣe idiwọ eyikeyi awọn ibaraenisepo elekitirosita laarin LLPS ati amuaradagba.Apeere ti itọpa akoko ti moleku kan ni a le rii ni aworan 7a.FCCS/FCS onínọmbà (agbelebu-ibaramu, CC ati autocorrelation, AC) fihan wipe aggregates ti o ni αS ati tau wà lọpọlọpọ ninu awọn ayẹwo (wo CC ti tẹ ni Ọpọtọ. 7b, osi nronu), ati awọn ẹya excess ti aloku monomeric amuaradagba dide bi a esi ti awọn fomipo ilana (wo AC ekoro ni Figure 7b, osi nronu).Awọn adanwo iṣakoso ti a ṣe labẹ awọn ipo ojutu kanna ni lilo awọn apẹẹrẹ ti o ni awọn ọlọjẹ monomeric nikan ko fihan awọn iṣipopada CC, ati pe awọn iṣipopada AC ni ibamu daradara pẹlu awoṣe itọka apakan-ọkan (Eq. 4), nibiti awọn ọlọjẹ monomeric ti ni awọn ifọkansi kaakiri ti o nireti (Fig. 7b). ), apa ọtun).Olusọdipúpọ pinpin ti awọn patikulu akojọpọ ko kere ju 1 µm2/s, ati pe ti awọn ọlọjẹ monomeric jẹ nipa 1 µm2/s.50–100 µm/s;awọn iye jẹ iru si awọn iye ti a tẹjade tẹlẹ fun sonicated αS amyloid fibrils ati monomeric αS lọtọ labẹ awọn ipo ojutu kanna44.Nigbati a ba ṣe atupale awọn akojọpọ pẹlu itupalẹ bugbamu TCCD (Fig. 7c, oke nronu), a rii pe ninu akojọpọ ti o ya sọtọ kọọkan (αS/Tau heteroaggregate), nipa 60% ti awọn akojọpọ ti a rii ni awọn mejeeji αS ati tau, nipa 30% wa ninu nikan. Tau, nipa 10% αS nikan.Ayẹwo Stoichiometric ti αS / Tau heteroaggregates fihan pe pupọ julọ awọn heteroaggregates ti ni idarato ni tau (stoichiometry ni isalẹ 0.5, nọmba apapọ ti awọn ohun elo tau fun apapọ jẹ awọn akoko 4 diẹ sii ju awọn ohun elo αS), eyiti o ni ibamu pẹlu iṣẹ wa ti a ṣe akiyesi ni FLIM ni aaye. adanwo..Onínọmbà FRET fihan pe awọn akojọpọ wọnyi ni awọn ọlọjẹ mejeeji ninu, botilẹjẹpe awọn iye FRET gangan ninu ọran yii kii ṣe pataki nla, nitori pinpin awọn fluorophores ni apapọ kọọkan jẹ laileto nitori apọju ti amuaradagba ti ko ni aami ti a lo ninu idanwo naa.O yanilenu, nigba ti a ba ṣe itupalẹ kanna nipa lilo 45,46 ogbo amyloid aggregation-deficient Tau variant (wo Apoti afikun. 11a,b), a ṣe akiyesi pe biotilejepe αS electrostatic aggregation jẹ kanna (Afikun Fig. 11c, d), agbara lati ṣẹda awọn akojọpọ laarin coacervate ti dinku pupọ ati pe FLIM ṣe awari ọpọlọpọ awọn aaye ni awọn adanwo ni ipo, ati awọn iṣipopada ibamu-agbelebu ti ko lagbara ni a ṣe akiyesi fun awọn ayẹwo apapọ ti o ya sọtọ.Bibẹẹkọ, fun nọmba kekere ti awọn akojọpọ ti a rii (nikan idamẹwa ti Tau441), a ṣe akiyesi pe apapọ apapọ kọọkan jẹ idarato ni αS ju iyatọ Tau yii, pẹlu isunmọ 50% ti awọn akopọ ti a rii ti o ni awọn ohun elo αS nikan, ati pe αS jẹ oriṣiriṣi pupọ ju. .awọn akojọpọ (wo Aworan Afikun. 11e), ni idakeji si awọn akojọpọ oriṣiriṣi ti ipilẹṣẹ nipasẹ Tau441 (Fig. 6f).Awọn abajade ti awọn adanwo wọnyi fihan pe botilẹjẹpe αS funrararẹ ni o lagbara lati ṣajọpọ pẹlu tau laarin coacervate, tau nucleation jẹ ọjo diẹ sii labẹ awọn ipo wọnyi, ati awọn akojọpọ amyloid-bi ti o ni abajade ni anfani lati ṣiṣẹ bi fọọmu ti αS ati tau.Sibẹsibẹ, ni kete ti mojuto tau-rich ti ṣẹda, awọn ibaraenisepo heterotypic laarin αS ati tau jẹ ojurere ni awọn akojọpọ lori awọn ibaraenisepo homotypic laarin awọn ohun elo tau;a tun ṣe akiyesi awọn nẹtiwọki amuaradagba ni omi αS/tau coacervates.
Aṣoju fluorescence awọn itọpa akoko ti awọn moleku ẹyọkan ti awọn akojọpọ sọtọ ti a ṣẹda ni αS/Tau441 electrostatic coacervates.Bursts ti o ni ibamu si αS / Tau441 coaggregates (ti nwaye loke ẹnu-ọna itọkasi) ni a ṣe akiyesi ni awọn ikanni wiwa mẹta (AF488 ati Atto647N itujade lẹhin itusilẹ taara, awọn laini bulu ati pupa, Atto647N itujade lẹhin itusilẹ aiṣe-taara), FRET, laini violet).b FCS/FCCS ayẹwo ti a ti ya sọtọ αS/Tau441 aggregates gba lati LLPS (osi nronu).Autocorrelation (AC) ekoro fun AF488 ati Atto647N wa ni han ni bulu ati pupa, lẹsẹsẹ, ati agbelebu-ibaramu (CC) ekoro ni nkan ṣe pẹlu aggregates ti o ni awọn mejeeji dyes wa ni afihan ni eleyi ti.Awọn iyipo AC ṣe afihan wiwa ti aami monomeric ati awọn eya amuaradagba ti a kojọpọ, lakoko ti awọn iyipo CC ṣe afihan itankale awọn akojọpọ aami-meji nikan.Itupalẹ kanna, ṣugbọn labẹ awọn ipo ojutu kanna bi ni awọn aaye ti o ya sọtọ, awọn ayẹwo ti o ni monomeric αS ati Tau441 nikan ni a fihan bi awọn idari ni apa ọtun.c Itupalẹ filasi Fluorescence ti awọn moleku ẹyọkan ti awọn akojọpọ sọtọ ti a ṣẹda ni αS/Tau441 electrostatic coacervates.Alaye fun apapọ kọọkan ti a rii ni awọn atunwi oriṣiriṣi mẹrin (N = 152) jẹ igbero si stoichiometry wọn, awọn iye S, ati ṣiṣe FRET (panel oke, ọpa awọ ṣe afihan iṣẹlẹ).Awọn iru akojọpọ mẹta ni a le ṣe iyatọ: -aS-nikan awọn akojọpọ pẹlu S ~ 1 ati FRET ~ 0, Tau-only aggregates pẹlu S ~ 0 ati FRET ~ 1, ati orisirisi Tau / αS aggregates pẹlu agbedemeji S ati FRET Awọn iṣiro iye naa. ti awọn ọlọjẹ asami mejeeji ti a rii ni akojọpọ oriṣiriṣi oriṣiriṣi (N = 100) ni a fihan ni nronu isalẹ (iwọn awọ ṣe afihan iṣẹlẹ naa).A pese data aise ni irisi awọn faili data aise.
Awọn maturation tabi ti ogbo ti awọn amuaradagba olomi condensates sinu jeli-bi tabi awọn ẹya ti o lagbara ni akoko pupọ ni a ti royin pe o ni ipa ninu ọpọlọpọ awọn iṣẹ iṣe-ara ti condensate47 bakannaa ninu arun, gẹgẹbi ilana ajeji ti o ṣaju amyloid aggregation 7, 48, 49. Nibi a ṣe iwadi ipinya alakoso ati ihuwasi ni awọn alaye.LSPT αS niwaju awọn polycations laileto ni agbegbe iṣakoso ni awọn ifọkansi micromolar kekere ati awọn ipo ti o ni ibatan ti ẹkọ iṣe-ara (akiyesi pe ifọkansi ti ẹkọ iṣe-ara ti αS jẹ> 1 µM50), ni atẹle ihuwasi imudani thermodynamically ti LPS.A rii pe αs, eyiti o ni agbegbe ti o lagbara ni agbara C-ebute ni awọn ibi isunmi olomi, condensation eka niwaju awọn macromolecules akopọ.Ilana yii le ni awọn ipa ti o yẹ ni agbegbe cellular nibiti αS ṣe alabapade ọpọlọpọ awọn ohun elo polycationic ti o ni nkan ṣe pẹlu akopọ ti o ni nkan ṣe pẹlu arun mejeeji ni vitro ati ni vivo51,52,53,54.
Ninu ọpọlọpọ awọn ijinlẹ, awọn agbara amuaradagba laarin awọn isun omi ni a ti gbero bi ọkan ninu awọn ifosiwewe bọtini ti npinnu ilana idagbasoke55,56.Ninu αS elekitirotaki pẹlu awọn polycations, ilana maturation nkqwe da lori agbara awọn ibaraenisepo pẹlu polycations, valence, ati isodipupo ti awọn ibaraenisepo wọnyi.Imọye iwọntunwọnsi ni imọran pe ala-ilẹ iwọntunwọnsi ti awọn ipinlẹ omi meji yoo jẹ wiwa ti droplet nla kan ti o ni ọlọrọ ni awọn biopolymers ti o wakọ LLPS57,58.Idagba idọti le jẹ aṣeyọri nipasẹ Ostwald maturation59, coalescence60 tabi lilo monomer ọfẹ ni pipin kaakiri phase61.Fun αS ati Tau441, ΔNt-Tau tabi pLK, pupọ julọ amuaradagba ni ogidi ninu condensate labẹ awọn ipo ti a lo ninu iwadi yii.Bibẹẹkọ, lakoko ti awọn droplets tau ti o ni kikun ti ṣajọpọ ni iyara lori rirọ dada, isọdọkan droplet ati rirọ jẹ nira fun ΔNt-Tau ati pLK, ni iyanju isonu iyara ti awọn ohun-ini olomi ninu awọn eto meji wọnyi.Gẹgẹbi itupalẹ FLIM-FRET wa, pLK ti ogbo ati awọn droplets ΔNt-Tau ṣe afihan iwọn kanna ti apapọ amuaradagba (igbesi aye fluorescence ti o jọra) bi awọn droplets atilẹba, ni iyanju pe nẹtiwọọki amuaradagba atilẹba ti wa ni idaduro, botilẹjẹpe lile diẹ sii.
A ṣe alaye awọn abajade esiperimenta wa ni awoṣe atẹle (Aworan 8).Awọn droplets ti o ṣẹda lakoko igba diẹ jẹ awọn nẹtiwọọki amuaradagba nigbagbogbo laisi isanpada elekitirotiki, ati nitorinaa awọn agbegbe ti aiṣedeede idiyele wa, paapaa ni wiwo droplet, ti o fa awọn droplets pẹlu agbara dada elekitirostatic giga.Lati sanpada fun idiyele (iṣẹlẹ kan ti a tọka si bi idinku valence) ati dinku agbara dada ti awọn droplets, awọn droplets le ni awọn polypeptides tuntun lati apakan dilute, tunto awọn nẹtiwọọki amuaradagba lati mu awọn ibaraẹnisọrọ idiyele idiyele ṣiṣẹ, ati ibaraenisepo pẹlu awọn droplets miiran.pẹlu awọn ipele (wetting).Awọn droplets αS / pLK, nitori nẹtiwọki amuaradagba ti o rọrun wọn (awọn ibaraẹnisọrọ heterotypic nikan laarin αS ati pLK) ati ifarapọ ti o pọju fun awọn ibaraẹnisọrọ amuaradagba-amuaradagba, dabi pe o le ṣe iwontunwonsi idiyele ti condensate ni kiakia;nitootọ, a ṣe akiyesi awọn kinetics amuaradagba yiyara ni ipilẹṣẹ αS/pLK coacervates akọkọ ju ni αS/Tau.Lẹhin idinku valence, awọn ibaraẹnisọrọ di diẹ ephemeral ati awọn droplets padanu awọn ohun-ini omi wọn ati ki o yipada si gel-like, awọn droplets ti ko ni ina pẹlu agbara ti o pọju elekitirostatic kekere (ati nitorina ko lagbara lati tutu oju).Ni idakeji, awọn droplets αS/Tau ko ṣiṣẹ daradara ni jijẹ iwọntunwọnsi idiyele droplet nitori awọn nẹtiwọọki amuaradagba diẹ sii (pẹlu mejeeji homotypic ati awọn ibaraẹnisọrọ heterotypic) ati iseda alailagbara ti awọn ibaraẹnisọrọ amuaradagba.Eyi ni abajade ni awọn isun omi ti o ni idaduro ihuwasi omi fun awọn akoko gigun ati ṣafihan agbara dada elekitirosita giga ti o duro lati dinku nipasẹ isọdọkan ati dagba (bayi ni idinku agbegbe dada/ ipin iwọn didun ti awọn droplets) ati nipa rirọ chem dada hydrophilic.Eyi ṣẹda awọn ile-ikawe amuaradagba ifọkansi nla ti o ṣe idaduro awọn ohun-ini ito bi awọn ibaraenisepo ṣe wa ni igba diẹ nitori wiwa igbagbogbo fun iṣapeye idiyele ninu nẹtiwọọki amuaradagba.O yanilenu, awọn fọọmu N-terminally truncated ti Tau, pẹlu diẹ ninu awọn isoforms62 ti o nwaye nipa ti ara, ṣe afihan ihuwasi agbedemeji, pẹlu diẹ ninu awọn coacervates ti ogbo pẹlu αS sinu awọn droplets ti o ni geli gigun, lakoko ti awọn miiran yipada si awọn condensates omi nla.Iwa-meji yii ni idagbasoke ti αS electrostatic coacervates ni ibamu pẹlu imọ-jinlẹ LLPS aipẹ ati awọn iwadii esiperimenta ti o ti ṣe idanimọ ibamu laarin idinku valence ati siving electrostatic ni awọn condensates bi bọtini si ṣiṣakoso iwọn condensate ati awọn ohun-ini ito.Ọna ẹrọ 58.61.
Eto yii ṣe afihan ipa ọna ikojọpọ amyloid putative fun αS ati Tau441 nipasẹ LLPS ati LSPT.Pẹlu afikun anion-ọlọrọ (pupa) ati cation-ọlọrọ (bulu) awọn agbegbe, αS ati tau electrostatic coacervates pẹlu itelorun valence ni kekere dada agbara ati nitorina kere coalescence, Abajade ni dekun droplet ti ogbo.Ipo jeli iduroṣinṣin ti ko ni agglomerated ti waye..Ipo yii jẹ ọjo pupọ ninu ọran ti eto αS / pLK nitori isunmọ ti o ga julọ ati nẹtiwọọki ibaraenisepo amuaradagba-pair ti o rọrun, eyiti ngbanilaaye fun iyipada gel-bi iyara.Ni ilodi si, awọn droplets pẹlu valence ti ko ni itẹlọrun ati, nitorinaa, awọn agbegbe ti o gba agbara amuaradagba ti o wa fun ibaraenisepo, jẹ ki o rọrun fun coacervate lati dapọ ati ki o tutu dada hydrophilic lati le dinku agbara dada giga rẹ.Ipo yii jẹ ayanfẹ fun αS/Tau441 coacervates, eyiti o ni nẹtiwọọki eka multivalent ti o ni awọn alailagbara Tau-Tau ati awọn ibaraẹnisọrọ αS-Tau.Ni ọna, awọn coacervates ti o tobi julọ yoo ni imurasilẹ da duro diẹ sii awọn ohun-ini ti omi-ara wọn, gbigba awọn ibaraenisepo amuaradagba-si-amuaradagba miiran lati ṣẹlẹ.Nigbamii, amyloid heterogeneous aggregates ti o ni awọn mejeeji αS ati tau fọọmu laarin awọn coacervate omi, eyi ti o le jẹ ibatan si awọn ti a ri ni awọn ara ifisi, eyi ti o jẹ ami ti neurodegenerative arun.
Awọn ẹya ti o dabi omi nla ti a ṣẹda lakoko idagbasoke ti αS/Tau441 pẹlu agbegbe amuaradagba ti o ni agbara pupọ ṣugbọn ti o ni agbara ati, si iwọn diẹ, αS/ΔNt-Tau coacervates jẹ awọn ifiomipamo pipe fun iparun ti akopọ amuaradagba.Nitootọ a ti ṣakiyesi idasile awọn akojọpọ amuaradagba to lagbara ni iru awọn coacervates amuaradagba, nigbagbogbo ti o ni awọn mejeeji αS ati tau ninu.A ti fihan pe awọn heteroaggregates wọnyi jẹ iduroṣinṣin nipasẹ awọn ibaraenisepo ti kii ṣe itanna, ni anfani lati di awọn awọ ThT amyloid-pato ni ọna kanna gẹgẹbi awọn fibrils amyloid aṣoju, ati nitootọ ni iru resistance si awọn ipa pupọ.Awọn akojọpọ αS/tau ti a ṣe nipasẹ LLPS ni a fihan lati ni awọn ohun-ini amyloid.Nitootọ, iyatọ ti ogbo ti aipe Tau ni apapọ amyloid jẹ ailagbara pataki ni didasilẹ awọn akojọpọ αS oniruuru wọnyi laarin coacervate omi elekitirotatiki.Ibiyi ti αS/Tau441 aggregates ni a ṣe akiyesi nikan inu awọn coacervates, eyiti o daduro awọn ohun-ini olomi-bi, ati rara, ti awọn coacervates / droplets ko de ipo gel.Ninu ọran ti o kẹhin, agbara ti o pọ si ti awọn ibaraenisepo electrostatic ati, bi abajade, rigidity ti nẹtiwọọki amuaradagba ṣe idiwọ awọn atunto ibaramu pataki ti awọn ọlọjẹ lati fi idi awọn ibaraẹnisọrọ amuaradagba tuntun ṣe pataki fun iparun amyloid.Sibẹsibẹ, eyi le ṣee ṣe ni irọrun diẹ sii, awọn coacervates omi-bi, eyiti o le jẹ diẹ sii lati wa omi bi wọn ti n pọ si ni iwọn.
Otitọ pe dida awọn akojọpọ laarin ipele ti o ni itara jẹ ayanfẹ ni awọn condensates αS / Tau nla ju ni awọn isunmi kekere ti o yarayara gel, ṣe afihan ibaramu ti idamo awọn ifosiwewe ti o ṣakoso isọdọkan droplet.Nitorinaa, kii ṣe ifarahan nikan fun ipinya alakoso, ṣugbọn iwọn ti condensate gbọdọ wa ni iṣakoso fun iṣẹ ṣiṣe to dara bii idena arun58,61.Awọn abajade wa tun ṣe afihan pataki ti iwọntunwọnsi laarin LLPS ati LSPT fun eto αS/Tau.Lakoko ti iṣelọpọ droplet le daabobo lodi si ikojọpọ amyloid nipa idinku iye awọn monomers amuaradagba ti o wa labẹ awọn ipo itẹlọrun, bi a ti daba ni awọn ọna ṣiṣe miiran63,64, idapọmọra droplet ni awọn ipele droplet giga le ja si akopọ amuaradagba inu nipasẹ awọn atunto conformational ti o lọra.awọn nẹtiwọki amuaradagba..
Lapapọ, data wa tẹnumọ ibaramu ti valence iṣọpọ ati itẹlọrun / awọn ibaraenisepo ti ko ni itẹlọrun ni awọn nẹtiwọọki ju silẹ ni aaye ti LSPT.Ni pato, a fihan pe awọn condensates αS/Tau441 ti o ni kikun ni anfani lati fiusi daradara ati nukleate lati ṣe amyloid-like heteroaggregates ti o ni awọn ọlọjẹ mejeeji ati pe o dabaa ẹrọ molikula ti o da lori awọn esi esiperimenta wa.Ijọpọ ti awọn ọlọjẹ meji ni αS/Tau ito coacervate ti a jabo nibi le nitootọ ni ibatan si isọpọ agbegbe ti awọn ọlọjẹ meji ninu awọn ifisi, eyiti o jẹ ami-ami ti arun na, ati pe o le ṣe alabapin si oye ibatan laarin LLPS ati amyloid aggregation, paving awọn ọna fun gíga gba agbara IDP ni neurodegeneration.
Monomeric WT-αS, awọn mutanti cysteine ​​(Q24C-αS, N122C-αS) ati awọn iyatọ ΔCt-αS (Δ101-140) ni a sọ ni E. coli ati mimọ bi a ti ṣalaye tẹlẹ.5 mM DTT wa ninu gbogbo awọn igbesẹ ni isọdọtun ti awọn mutanti αS cysteine ​​lati ṣe idiwọ didasilẹ mnu disulfide.Tau441 isoform (plasmid ti a gba lati ọdọ Addgene #16316), iyatọ ΔNt-Tau (Δ1-150, ti a gba nipasẹ cloning IVA pẹlu awọn alakoko CTTTAAGAAGGAGATACATATGATCGCCACACACCGGG, CATATGTATATCCTCTCTTCTTAAAGTTAAAC) ati AggDef-Tau7-iyipada-GACTTAAC, ati AggDef-Tau7-P5. asa wà dagba si OD600 = 0.6-0.7 ni 37°C ati 180 rpm, ati ikosile ti a fa pẹlu IPTG fun wakati 3 ni 37°C.Awọn sẹẹli ikore ni 11,500 xg fun awọn iṣẹju 15 ni 4 °C ki o si wẹ pẹlu ifipamọ iyọ ti o ni 150 mM NaCl.Tun pellet pada ni ifipamọ lysis (20 milimita fun 1 L LB: MES 20 mM, pH 6.8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0.2 mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, benzamidine 50 μM, copeptin).Igbesẹ sonication ni a ṣe lori yinyin pẹlu titobi ti 80% fun awọn pulses 10 (1 min lori, 1 min kuro).Maṣe kọja 60 milimita ninu olutirasandi kan.E. coli lysates ti gbona ni 95 ° C. fun awọn iṣẹju 20, lẹhinna tutu lori yinyin ati centrifuged ni 127,000 × g fun awọn iṣẹju 40.Supernatant ti o ṣe alaye ni a lo si awo awọ 3.5 kDa kan (Spectrum ™ Thermo Fisher Scientific, UK) ati pe a ṣe itọrẹ si 4 L ti ifipamọ itọsẹ (20 mM MES, pH 6.8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, DTT 2 mM , PMSF 0.1 mM) fun awọn wakati 10.Iwe paṣipaarọ cation 5 milimita kan (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, USA) jẹ iwọntunwọnsi pẹlu ifipamọ iwọntunwọnsi (20 mM MES, pH 6.8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.1 mM PMSF).Tau lysate ti wa ni filtered nipasẹ 0.22 μm PVDF àlẹmọ ati itasi sinu ọwọn ni iwọn sisan ti 1 milimita/min.Elution ti gbe jade ni diėdiė, tau ti gbe jade pẹlu 15–30% buffer elution (20 mM MES, pH 6.8, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0.1 mM PMSF).Awọn ida ni a ṣe atupale nipasẹ SDS-PAGE, ati pe awọn ida eyikeyi ti o ni ẹgbẹ kan pẹlu iwuwo molikula ti a nireti ti tau ni ogidi nipa lilo àlẹmọ centrifuge 10 kDa ati rọpo pẹlu ifipamọ ti o ni 10 mM HEPES, pH 7.4, NaCl 500 mM ati DTT 2 mM fun ifọkansi amuaradagba ikẹhin jẹ 100 μM.Ojutu amuaradagba lẹhinna kọja nipasẹ 0.22 μm PVDF àlẹmọ, ni iyara tio tutunini ati fipamọ ni -80°C.Amuaradagba K18 ti pese pẹlu aanu nipasẹ Ọjọgbọn Alberto Boffi.Mimo ti igbaradi jẹ> 95% bi a ti fi idi rẹ mulẹ nipasẹ SDS-PAGE ati MALDI-TOF/TOF.Orisirisi awọn cysteines ni aami kemikali pẹlu AlexaFluor488-maleimide (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) tabi TEMPOL-maleimide (Kemikali Iwadi Toronto, Toronto, Canada).won timo nipa absorbance ati MALDI-TOF/TOF.Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau ati K18 ni aami pẹlu awọn iyokù cysteine ​​abinibi ni awọn ipo 191 ati 322 ni lilo Atto647N-maleimide (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Germany) ni atẹle ilana kanna.Iye owo apapọ fun awọn maapu iyokù fun αS ati Tau441 ni a ṣe ipilẹṣẹ ni lilo CIDER66.
Poly-L-lysine ti o lagbara (pLK DP 90-110 ni ibamu si NMR lati ọdọ olupese, Alamanda Polymers Inc, Huntsville, Alabama, USA) ni tituka ni 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 7.4 si 10 mM ifọkansi, ilana sonicated fun 5 iṣẹju ni ohun ultrasonic omi iwẹ ati itaja ni -20 °C.PEG-8, dextran-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, USA) ati FITC-dextran-500 (Sigma -Aldrich, Sant Louis, MI, USA) jẹ omi tiotuka ati pinpin kaakiri ni ifipamọ LLPS.Dialysis yọ iyọ ti o bajẹ kuro.Lẹhinna wọn ṣe iyọ nipasẹ àlẹmọ syringe pẹlu iwọn pore ti 0.22 μm, ati pe awọn ifọkansi wọn ṣe iṣiro nipa lilo refractometer (Mettler Toledo, Columbus, Ohio, USA).Awọn ayẹwo LLPS ni a pese sile ni iwọn otutu yara ni ilana atẹle: ifipamọ ati extrusion ni a dapọ ati 1 mM tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP, Carbosynth, Compton, UK), 1 mM 2,2,2,2- (Ethane-) 1, 2-diyldinitrile) tetraacetic acid (EDTA, carboxynth) ati adalu 1% protease inhibitor (PMSF 100 mM, benzamide 1 mM, leupeptin 5 μM).Lẹhinna αS ati awọn polycations ti o dapọ (awọn aṣayan pLK tabi Tau) ti wa ni afikun.Fun awọn adanwo jara akoko thioflavin-T (ThT, Carbosynth, Compton, UK), lo apapọ ifọkansi ThT lati jẹ idaji ifọkansi αS.Ni rọra ṣugbọn dapọ awọn ayẹwo daradara lati rii daju pe wọn jẹ isokan.Ifojusi ti paati kọọkan yatọ lati idanwo lati ṣe idanwo, bi a ti ṣalaye ninu apakan Awọn abajade.A lo Azide ni ifọkansi ti 0.02% (w/v) nigbakugba ti iye akoko idanwo naa kọja awọn wakati 4.Fun gbogbo awọn itupalẹ nipa lilo awọn ayẹwo LLPS, gba adalu laaye lati dọgbadọgba fun awọn iṣẹju 5 ṣaaju itupalẹ.Fun itupalẹ itọka ina, 150 µl ti awọn ayẹwo ni a kojọpọ sori awọn microplates 96-daradara ti kii ṣe abuda (µClear®, dudu, F-Bottom/Chimney Well, Greiner bio-one, Kremsmünster, Austria) ati ti a bo pelu fiimu alemora.Awọn LLP ni abojuto nipasẹ wiwọn gbigba ni 350 nm ni aarin ojutu ni oluka awo CLARIOstar (BMG Labtech, Ortenberg, Germany).Awọn idanwo naa ni a ṣe ni ilọpo mẹta ni 25 ° C, ati pe awọn aṣiṣe ni a ṣe iṣiro bi iyapa boṣewa lati iwọn.Ipele dilute jẹ iwọn nipasẹ centrifugation ayẹwo ati itupalẹ gel SDS-PAGE, ati ida αS ninu dilute ati awọn ipele ifọkansi ti ni iwọn ni ọpọlọpọ awọn solusan LLPS.Apeere 100 μl LLPS ti o ni aami 1 μM AF488 ti o ni aami αS ti pese sile nipasẹ dapọ ni kikun ti o tẹle nipasẹ centrifugation ni 9600 × g fun awọn iṣẹju 30, lẹhin eyi ni ojoro nigbagbogbo han.Oke 50 μl ti supernatant ni a lo fun titobi amuaradagba nipa lilo gel SDS-PAGE.A ṣe ayẹwo awọn gels pẹlu awọn asẹ AF488 nipa lilo eto aworan gel ChemiDoc (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) tabi abariwọn pẹlu abawọn Coomassie ati wiwo pẹlu awọn asẹ ti o yẹ.A ṣe atupale awọn ẹgbẹ abajade nipa lilo AworanJ version 1.53i (Awọn ile-iṣẹ Ilera ti Orilẹ-ede, AMẸRIKA).Awọn idanwo naa ni a ṣe ni ẹda-ẹda ni awọn adanwo oriṣiriṣi meji pẹlu awọn abajade ti o jọra.
Ni deede, 150 μl ti awọn ayẹwo ni a lo si awọn microplates 96-daradara ti kii ṣe abuda ati wiwo ni iwọn otutu yara lori Leica DMI6000B microscope inverted (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany).Fun awọn adanwo iranran, µ-Slide Angiogenesis plates (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany) tabi awọn microplates polystyrene daradara 96 ​​(Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts) ni a tun lo.EL6000 halogen tabi awọn atupa halide irin mekiuri ni a lo bi awọn orisun itanna (fun BF/DIC ati aworan WF, lẹsẹsẹ).Fun maikirosikopu WF, ipinnu afẹfẹ 40x magnification (Leica Microsystems, Jẹmánì) ni a lo lati dojukọ ina lori apẹẹrẹ ati gba.Fun AF488 ati awọn ayẹwo aami ThT, iyọda àlẹmọ ati itujade pẹlu awọn eto àlẹmọ GFP boṣewa, inudidun ati awọn asẹ bandpass, ni atele, 460-500 nm ati 512-542 nm bandpass awọn asẹ, ati digi dichroic 495 nm.Fun awọn ayẹwo ti a samisi pẹlu Atto647N, ipilẹ boṣewa ti awọn asẹ Cy5 pẹlu ayọ ati itujade bandpass asẹ 628–40 nm ati 692–40 nm, lẹsẹsẹ, ati digi dichroic 660 nm ni a lo.Fun BF ati maikirosikopu DIC, lo ibi-afẹde ikojọpọ ina tan imọlẹ kanna.Imọlẹ ti a gba ti gba silẹ lori kamẹra Leica DFC7000 CCD (Leica Microsystems, Germany).Akoko ifihan jẹ 50 ms fun aworan microscopy BF ati DIC ati 20-100 ms fun aworan maikirosikopu WF.Fun lafiwe, akoko ifihan fun gbogbo awọn adanwo pẹlu ThT jẹ 100 ms.Awọn adanwo-akoko-akoko ni a ṣe lati wo oju inu isọpọ droplet, pẹlu awọn aworan ti a gba ni gbogbo 100 ms fun awọn iṣẹju pupọ.ImageJ (NIH, USA) ni a lo fun itupalẹ aworan.Awọn idanwo naa ni a ṣe ni ilọpo mẹta pẹlu awọn abajade kanna.
Fun awọn adanwo colocalization, FRAP ati atunkọ 3D, awọn aworan ti wa lori Zeiss LSM 880 inverted confocal maikirosikopu nipa lilo ẹda buluu ZEN 2 kan (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Germany).Awọn ayẹwo ti 50 µl ni a lo si awọn ounjẹ µ-Slide Angiogenesis Petri (Ibidi GmbH, Gröfelfing, Jẹmánì), ti a tọju pẹlu polymer hydrophilic kan (ibiTreat) ati ti a gbe sinu ibi immersion epo 63 × (Eto-Apochromat 63 ×/NA 1.4 Oil) lori DIC).Awọn aworan ni a gba ni lilo 458 nm, 488 nm, ati 633 nm awọn laini laser argon pẹlu ipinnu ti 0.26 µm/piksẹli ati akoko ifihan ti 8 μs/pixel fun itusilẹ ati awọn window wiwa itujade ti 470-600 nm, 493-628 nm, ati 638–755 nm ni a lo lati wo ThT, AF488 ati Atto647N, lẹsẹsẹ.Fun awọn adanwo FRAP, fọtoyiya akoko-pipe ti ayẹwo kọọkan ni a gbasilẹ ni 1 fireemu fun iṣẹju-aaya.Awọn idanwo naa ni a ṣe ni ilọpo mẹta ni iwọn otutu yara pẹlu awọn abajade kanna.Gbogbo awọn aworan ni a ṣe atupale nipa lilo sọfitiwia ẹda buluu Zen 2 (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Jẹmánì).Awọn iyipo FRAP ni a ṣe deede, igbero ati ni ibamu si kikankikan / data akoko ti a fa jade lati awọn aworan ni lilo Zen 2 ni lilo OriginPro 9.1.Awọn iṣipopada imularada ti ni ibamu si awoṣe alapin monomono kan lati ṣe akọọlẹ fun itọka molikula pẹlu ọrọ afikun afikun lati ṣe akọọlẹ fun ipa ifunmọ gbigba.Lẹhinna a ṣe iṣiro D nipa lilo radius bleaching ipin ati ipinnu idaji-aye imularada ti a ti pinnu tẹlẹ bi ninu idogba ti Kang et al.5 35 han.
Awọn iyatọ cysteine ​​nikan ti αS ni a ṣepọ pẹlu 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-N-oxyl (TEMPOL) ni awọn ipo 24 (TEMPOL-24-αS) ati 122 (TEMPOL-122-αS), lẹsẹsẹ.Aami Aami Spin Fun awọn adanwo EPR, ifọkansi αS ti ṣeto ni 100 μM ati pe ifọkansi PEG jẹ 15% (w/v).Fun ọpọlọpọ awọn ipo iṣakojọpọ, ipin αS: pLK jẹ 1:10, lakoko ti o jẹ itọju αS:ΔNt-Tau ati αS: Tau441 ni 1:1.Fun awọn adanwo titration abuda ni isansa ti apejọ, TEMPOL-122-αS ni itọju ni 50 μM ati awọn polycations ti wa ni titrated ni awọn ifọkansi ti o pọ si, ngbaradi ipo kọọkan lọtọ.Awọn wiwọn CW-EPR ni a ṣe ni lilo Bruker ELEXSYS E580 X-band spectrometer ti o ni ipese pẹlu Bruker ER4118 SPT-N1 resonator ti n ṣiṣẹ ni igbohunsafẹfẹ makirowefu (SHF) ti ~ 9.7 GHz.A ṣeto iwọn otutu ni 25°C ati iṣakoso nipasẹ omi nitrogen cryostat.Awọn iwoye naa ni a gba labẹ awọn ipo ti ko ni irẹwẹsi ni agbara MW ti 4 mW, titobi awose ti 0.1 mT, ati igbohunsafẹfẹ modulation ti 100 kHz.Awọn kikankikan Spectral ni a ṣe deede lati yago fun awọn iyatọ ninu awọn ifọkansi alayipo laarin awọn ayẹwo ati idinku iyipo ti o ṣeeṣe nitori awọn ifọkansi iyokù ti idinku awọn aṣoju ninu awọn ayẹwo ti o ni Tau441 tabi ΔNt-Tau (ti o wa ninu awọn solusan amuaradagba atilẹba).Awọn iye ti a fun ti g ni a gba bi abajade ti awoṣe iwoye EPR ti a ṣe ni lilo sọfitiwia Easyspin (v. 6.0.0-dev.34) ti a ṣe ni Matlab®67.Awọn awoṣe isotropic paati kan/meji ni a lo lati ṣe awoṣe data naa.Lẹhin ti o ṣe deede gbogbo awọn ifihan agbara, awọn iṣẹku ni a ṣe iṣiro nipasẹ iyokuro iṣeṣiro kọọkan lati irisi esiperimenta ti o baamu.Fun itupalẹ titration abuda, kikankikan ojulumo ti ẹgbẹ kẹta si ẹgbẹ keji ti iwoye EPR ti o ṣe deede (IIII/III) ni a lo lati ṣe atẹle ifaramọ ti awọn polycations si αS.Lati ṣe iṣiro ibakan pipinka (Kd), ọna abajade ti ni ibamu si awoṣe isunmọ ti a ro pe n aami ati awọn aaye abuda ominira.
Awọn idanwo iwoye NMR ni a ṣe ni lilo Bruker Neo 800 MHz (1H) spectrometer NMR ti o ni ipese pẹlu cryoprobe ati gradient Z.Gbogbo awọn adanwo ni a ṣe ni lilo 130-207 µM αS ati αS / ΔNt-Tau ati awọn deede pLK ni 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10% DO, pH 7.4 ati pe wọn ṣe ni 15 ° C.Lati ṣe atẹle LPS nipasẹ NMR, 10% PEG ni a ṣafikun si awọn apẹẹrẹ ti a dapọ tẹlẹ.Idite perturbation iyipada kemikali (Fig. 1b) fihan apapọ 1H ati 15N awọn iyipada kemikali.Awọn iwoye αS 2D1H-15N HSQC ni a sọtọ da lori iṣẹ iyansilẹ ti tẹlẹ (titẹsi BMRB #25227) ati timo nipasẹ gbigbasilẹ ati itupalẹ 3D spectra ti HNCA, HNCO ati CBCAcoNH.13Cα ati 13Cβ awọn iyipada kemikali ni a ṣe iṣiro ni iwaju ΔNt-Tau tabi pLK lati wiwọn awọn ayipada ti o ṣeeṣe ni awọn aṣa igbekalẹ ile-ẹkọ keji ni akawe si awọn iṣipopada kemikali αS ni conformation coil ID mimọ 68 (Eya Afihan 5c).Awọn oṣuwọn R1ρ ni a ṣewọn nipasẹ gbigbasilẹ hsqctretf3gpsi awọn adanwo (ti o gba lati inu ile-ikawe Bruker) pẹlu awọn idaduro ti 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400, ati 800 ms, ati pe awọn iṣẹ apinfunni ni atunṣe si awọn idaduro kikankikan ti o yatọ si awọn akoko lati pinnu R1ρ ati aidaniloju adanwo rẹ.
Awọn adanwo maikirosikopu fluorescence ti akoko-awọ meji-awọ ni a ṣe lori microscope confocal MT200 fluorescence ti akoko ti iṣowo (PicoQuant, Berlin, Germany) pẹlu ohun elo kika photon kan (TCSPC) kan ti o ni ibatan akoko.Olori diode lesa ti wa ni lilo fun pulsed interleaved excitation (PIE), tan ina kọja nipasẹ kan nikan mode waveguide ati ki o ti wa ni aifwy si kan lesa agbara ti 10 to 100 nW fun 481 nm ati 637 nm lesa laini won lẹhin kan dichroic digi.Eyi ṣe idaniloju oṣuwọn kika fọto ti o dara julọ, yago fun awọn ipa ti aliasing photon, fọtoyiya ati itẹlọrun.μ-Slide angiogenesis awọn ideri tabi awọn apẹrẹ (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Germany) ni a gbe taara sinu omi immersion lori Super Apochromat 60x NA 1.2 lẹnsi pẹlu kola atunṣe (Olympus Life Sciences, Waltham, USA).Dichroic digi 488/640 nm (Semrock, Lake Forest, IL, USA) ni a lo gẹgẹbi pipin ina akọkọ.Ìtọjú ti ko ni idojukọ jẹ dina nipasẹ iho kan pẹlu iwọn ila opin ti 50 microns, lẹhinna itọsi ti a dojukọ ti pin si awọn ọna wiwa 2 nipasẹ pipin ina 50/50.Awọn asẹ itujade Bandpass (Semrock, Lake Forest, IL, USA) 520/35 fun awọ alawọ ewe (AF488) ati 690/70 fun awọ pupa (Atto647N) ni a lo ni iwaju aṣawari naa.Awọn diodes avalanche photo-nikan (SPAD) (Awọn Ẹrọ Micro Photon, Bolzano, Italy) ni a lo bi awọn aṣawari.Mejeeji ikojọpọ data ati itupalẹ ni a ṣe ni lilo sọfitiwia SymphoTime64 ti o wa ni iṣowo (PicoQuant GmbH, Berlin, Jẹmánì).
Aadọta microliters ti awọn ayẹwo LLPS ni a lo si awọn kanga angiogenesis μ-Slide (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Jẹmánì).Awọn aworan abajade ti wa ni idojukọ si 20 µm loke isalẹ daradara fun aaye iṣẹ ṣiṣe to dara julọ fun awọn isunmi ti daduro ati si ~ 1 µm fun awọn rafts ati awọn aami pẹlu ipinnu axial ti o kere ju 0.25 µm/pixel ati akoko idaduro ti 400 µs/pixel.Yan data nipa lilo iloro agbara kan ti o da lori aropin iwọn ifihan agbara isale (PBG, tumọ + 2σ) fun ikanni kọọkan ki awọn droplets amuaradagba olomi nikan, awọn rafts, tabi awọn aaye ni a yan, sisẹ eyikeyi orisun ti o ṣeeṣe lati ipele ti tuka.Lati ṣe itupalẹ igbesi aye ti ẹda kọọkan (τ) ti ikanni kọọkan (alawọ ewe, “g” fun AF488 ati pupa, “r” fun Atto647N), a yan awọn agbegbe ti iwulo (ROIs) ti o ni awọn droplets, rafts, tabi awọn aaye (Afikun Aworan 1 ).8b) ati ti ari wọn nipa ibamu ibajẹ igbesi aye wọn (τD, τR ati τP fun awọn droplets, rafts tabi awọn aaye, lẹsẹsẹ, wo Afikun Ọpọtọ. 8c) ni ikanni kọọkan nipa lilo itupalẹ iru-ibamu ati awoṣe ibajẹ ẹya-meji.Apapọ τ lati τ.Awọn ROI ti o ṣe agbejade awọn fọto ti o kere ju fun ibamu-itumọ pupọ ni a yọkuro lati inu itupalẹ.Igekuro ti a lo jẹ <104 photons fun awọn rafts ati awọn aami ati 103 fun awọn isọ silẹ.Awọn droplets ni ẹnu-ọna kekere nitori pe o ṣoro lati gba awọn iyipo ibajẹ pẹlu awọn iye kikankikan ti o ga julọ, nitori awọn droplets ninu aaye aworan nigbagbogbo kere ati kere si lọpọlọpọ.Awọn ROI pẹlu awọn iṣiro photon loke opin ikojọpọ photon (ti a ṣeto si> awọn iṣiro 500/pixel) ni a tun danu fun itupalẹ.Baramu ọna ibajẹ kikankikan ti o gba lati agbegbe ti iwulo pẹlu kikankikan ni 90% ti o pọju (die-die lẹhin kikankikan ti o pọju ti ibajẹ) lati ibẹrẹ igbesi aye iṣẹ lati rii daju kikọlu IRF ti o kere ju lakoko ti o tọju kanna fun gbogbo ibajẹ kikankikan awọn eto Ojulumo akoko window A ṣe atupale 25 si 50 ROI fun awọn rafts ati awọn aaye ati 15-25 ROI fun awọn silė, awọn aworan ti a yan lati diẹ sii ju awọn ẹda 4 ti o gbasilẹ lati o kere ju awọn adanwo ominira 3.Awọn idanwo t-tailed meji ni a ti lo lati ṣe iṣiro awọn iyatọ iṣiro laarin awọn eya tabi laarin awọn eto coacervate.Fun itupalẹ piksẹli-nipasẹ-pixel ti igbesi aye (τ), attenuation lapapọ ti igbesi aye lori aaye fun ikanni kọọkan jẹ iṣiro ati isunmọ ti awoṣe attenuation exponential 2/3 ti a ṣe.Ilọkuro igbesi aye fun piksẹli kọọkan lẹhinna ni ibamu pẹlu awọn iye τ iṣiro iṣaaju, ti o mu abajade pseudocolor FLIM ti o baamu aworan.Iwọn igbesi aye iru-ibamu jẹ kanna ni gbogbo awọn aworan ti ikanni kanna, ati ibajẹ kọọkan ṣe agbejade awọn fọto ti o to lati pese ibamu ti o gbẹkẹle.Fun itupalẹ FRET, awọn piksẹli ni a yan nipa lilo ilo-ilẹ kikankikan kekere ti awọn fọto 100, eyiti o ṣe aropin ifihan agbara isale (FBG) ti awọn photon 11.Agbara fluorescence ti ikanni kọọkan ni a ṣe atunṣe nipasẹ awọn ifosiwewe atunse ti a pinnu idanwo: 69 spectral crosstalk α jẹ 0.004, itara taara β jẹ 0.0305, ṣiṣe wiwa γ jẹ 0.517.Iṣiṣẹ FRET ni ipele piksẹli lẹhinna ṣe iṣiro nipa lilo idogba atẹle:
nibiti FDD jẹ kikankikan fluorescence ti a ṣe akiyesi ni ikanni oluranlọwọ (alawọ ewe), FDA jẹ kikankikan fluorescence ti a ṣe akiyesi ni ikanni gbigba (pupa) labẹ itara aiṣe-taara, ati FAA jẹ kikankikan fluorescence ti a ṣakiyesi ni ikanni olugba (pupa) labẹ itara taara (pupa). PIE).Awọn iṣọn kikankikan Fuluorescence ni a ṣe akiyesi ni ikanni).
Gbe 100 µl ti awọn solusan idahun LLPS ti o ni 25 µM monomeric Tau441 ti ko ni aami (pẹlu tabi laisi 25 µM αS) ni ifipamọ LLPS (ti o ṣe afikun bi loke) lori awọn microplates 96-daradara ti kii ṣe abuda pẹlu ibori foil alemora ati iṣelọpọ droplet ti ṣayẹwo nipasẹ WF microscopy iwọntunwọnsi.laarin 10 min.Lẹhin awọn wakati 48 ti abeabo ni iwọn otutu yara, wiwa ti awọn raft amuaradagba ati awọn aaye ti jẹrisi.Lẹhinna farabalẹ yọ omi kuro lori awọn rafts lati awọn kanga, lẹhinna fi 50 L ti ifipamọ dissociation (10 mM HEPES, pH 7.4, 1 M NaCl, 1 mM DTT) ati incubate fun iṣẹju 10.Idojukọ iyọ ti o ga julọ ni idaniloju pe LLPS kii yoo tun ṣe nitori PEG ti o ku, ati pe awọn apejọ amuaradagba ti o ṣeeṣe ti o ṣẹda nipasẹ awọn ibaraenisọrọ elekitirosita yoo jẹ pipọ.Isalẹ kanga naa lẹhinna ni ifarabalẹ yọ kuro pẹlu imọran micropipette kan ati pe a ti gbe ojutu ti o yọrisi si akiyesi ṣofo daradara.Lẹhin abeabo ti awọn ayẹwo pẹlu 50 μM ThT fun 1 h, wiwa awọn aaye ti o ya sọtọ ni a ṣayẹwo nipasẹ WF microscopy.Mura sonicated αS fibrils nipa fifamọra 300 µl kan ti a ti 70-µM αS ojutu ni PBS pẹlu pH 7.4, soda azide 0.01% ni 37 °C ati 200 rpm lori orbital gbigbọn fun 7 ọjọ.Ojutu naa lẹhinna ni centrifuged ni 9600 × g fun awọn iṣẹju 30, pellet ti tun daduro ni PBS pH 7.4 ati sonicated (1 min, 50% cycle, 80% amplitude in a Vibra-Cell VC130 sonicator, Sonics, Newton, USA) awọn ayẹwo fibril pẹlu kan jo isokan iwọn pinpin ti kekere fibrils.
Onínọmbà FCS/FCCS ati iwari aiṣedeede awọ-meji (TCCD) ni a ṣe lori MT200 kanna-akoko ti o yanju fluorescent confocal microscope (Pico-Quant, Berlin, Germany) ti a lo fun awọn adanwo microscopy FLIM-FRET ni lilo ipo PIE.Agbara lesa fun awọn adanwo wọnyi ni a ṣafikun si 6.0 µW (481 nm) ati 6.2 µW (637 nm).Apapo ti awọn agbara ina lesa ni a yan lati ṣe agbejade imọlẹ ti o jọra fun awọn orisii fluorophores ti a lo lakoko ti o ṣaṣeyọri awọn oṣuwọn kika to dara julọ ati yago fun fọtoyiya ati itẹlọrun.Mejeeji ikojọpọ data ati itupalẹ ni a ṣe ni lilo sọfitiwia SymphoTime64 ti o wa ni iṣowo ti o wa 2.3 (PicoQuant, Berlin, Germany).
Awọn apẹẹrẹ ti awọn akojọpọ αS/Tau ti o ya sọtọ ti o gba ni lilo LLPS ti wa ni ti fomi ni ipinya ipinya si ifọkansi monomolecular ti o yẹ (ni deede 1: 500 dilution, niwọn igba ti awọn akojọpọ ti wa tẹlẹ ni awọn ifọkansi kekere nigbati o ya sọtọ lati awọn ayẹwo coacervate).Awọn ayẹwo ni a lo taara si awọn ideri (Corning, USA) ti a fi sii pẹlu ojutu BSA ni ifọkansi ti 1 mg/mL.
Fun itupalẹ PIE-smFRET ni alawọ ewe ati awọn ikanni pupa, iloro kikankikan kekere ti awọn photons 25 ni a lo lati ṣe àlẹmọ awọn ifihan agbara kekere ti o fa nipasẹ awọn iṣẹlẹ monomeric (akiyesi pe awọn monomers ju awọn ayẹwo akojọpọ ni akawe si awọn akojọpọ ti o ya sọtọ).Iwọn iloro yii jẹ iṣiro bi igba marun ni apapọ kikankikan ti monomeric αS ti o gba lati inu itupalẹ awọn ayẹwo monomer mimọ lati le yan awọn akojọpọ ni pataki fun itupalẹ.Circuit wakọ PIE, papọ pẹlu gbigba data TSCPC, ti ṣiṣẹ ohun elo ti àlẹmọ iwuwo igbesi aye ti o ṣe iranlọwọ imukuro isale ati isọ-ọrọ iwoye.Kikan igbunaya ti a yan nipa lilo awọn ala-ilẹ ti o wa loke ni a ṣe atunṣe nipa lilo ifihan agbara isale apapọ ti a pinnu lati awọn itan-akọọlẹ ti iṣẹlẹ dipo kikankikan/bin ti awọn ayẹwo-ipin nikan.Bursts ti o ni nkan ṣe pẹlu awọn akojọpọ nla ni igbagbogbo gba ọpọlọpọ awọn apoti itẹlera ni wiwa akoko (ṣeto si 1 ms).Ni awọn iṣẹlẹ wọnyi, a yan bin ti o pọju agbara.Fun FRET ati itupalẹ stoichiometric, a ti lo ifosiwewe gamma ni imọ-jinlẹ γ (0.517).Spectral crosstalk ati awọn idasi itara taara jẹ aifiyesi (ti pinnu ni idanwo) ni agbara ina lesa ti a lo.Iṣiṣẹ ati stoichiometry ti FRET ninu bugbamu jẹ iṣiro bi atẹle.