347 irin alagbara, irin coiled tubing kemikali paati, Idanimọ ti aramada interferon-idahun eda eniyan leukocyte antigen-A (HLA-A) chaperone awọn ọlọjẹ nipa lilo agbelebu-ti sopọ mọ mass spectrometry (CLMS)

O ṣeun fun lilo si Nature.com.O nlo ẹya ẹrọ aṣawakiri kan pẹlu atilẹyin CSS lopin.Fun iriri ti o dara julọ, a ṣeduro pe ki o lo ẹrọ aṣawakiri imudojuiwọn kan (tabi mu Ipo Ibamu ṣiṣẹ ni Internet Explorer).Ni afikun, lati rii daju atilẹyin ti nlọ lọwọ, a fihan aaye naa laisi awọn aza ati JavaScript.
Sliders nfihan awọn nkan mẹta fun ifaworanhan.Lo awọn ẹhin ati awọn bọtini atẹle lati gbe nipasẹ awọn ifaworanhan, tabi awọn bọtini idari ifaworanhan ni ipari lati gbe nipasẹ ifaworanhan kọọkan.

ọja Apejuwe

Irin alagbara, irin 347L Coil Tubes, Irin ite: SS347L

Eto isamisi interferon nfa idahun cytokine ti o lagbara si ọpọlọpọ awọn ifihan agbara pathogenic ati inu inu lati inu ayika, ti o mu abajade ti awọn ipin ti awọn ọlọjẹ interferon-inducible.A lo DSS-mediated cross-link mass spectrometry (CLMS) lati ṣe awari awọn ibaraenisepo amuaradagba-amuaradagba tuntun ni agbegbe ti awọn ọlọjẹ ti o fa interferon.Ni afikun si awọn ọlọjẹ interferon-inducible ti a ti ṣe yẹ, a tun ṣe idanimọ aramada intermolecular ati intramolecular cross-linked adducts ti awọn ọlọjẹ interferon-inducible canonical gẹgẹbi MX1, USP18, OAS3, ati STAT1.A dojukọ afọwọsi orthogonal ti eto aramada ti awọn nẹtiwọọki amuaradagba interferon-inducible ti a ṣẹda nipasẹ awọn ọlọjẹ HLA-A (H2BFS-HLA-A-HMGA1) ni lilo ajẹsara ajẹsara ati iwadi siwaju wọn nipa lilo awoṣe imudara molikula.Awoṣe ti awọn agbara imunadoko ti eka amuaradagba ṣe afihan ọpọlọpọ awọn aaye ibaraenisepo ti o ṣe afihan awọn ibaraenisepo ti a damọ ninu awọn awari CLMS.Papọ, a ṣe afihan iwadii awaoko ti CLMS lati ṣe idanimọ awọn eka ifihan agbara tuntun ti o fa nipasẹ interferon, ati nireti lilo gbooro ti CLMS lati ṣe idanimọ awọn agbara tuntun ti awọn ibaraenisepo amuaradagba ni microenvironment tumor.
Ṣaaju ki idahun ajẹsara imubadọgba kan to bẹrẹ, eto aabo abinibi ti agbalejo naa gbe esi esi antimicrobial ti o laja nipasẹ idile kan ti awọn cytokines alpha-helical ti a fi pamọ ti a pe ni interferons (IFNs).Iru I IFN awọn kilasi IFNa ati IFNβ mu awọn idahun cellular ṣiṣẹ, pẹlu antiviral, proapoptotic, proinflammatory, ati awọn ipinlẹ antiproliferative.Ninu eniyan, 13 subtypes ti IFNa ni a mọ, gbogbo wọn ti o wa lori chromosome 91. Iyalenu, IFNα2 nikan ni a ti kẹkọọ fun lilo iwosan.Laipe, akiyesi pataki ni a ti san si iwadii lori awọn iru-ẹda miiran ti IFNa.Iwadi kan laipe kan fihan pe IFNα14 jẹ ọkan ninu awọn isoforms ti o munadoko julọ ni ihamọ HBV2 ati HIV-13,4 ẹda ti a ṣe afiwe si subtype IFNα2 canonical.
A ti fi idi rẹ mulẹ pe iru ti ṣiṣẹ I interferon receptor complexes (IFNAR1 ati IFNAR2) nfa ifasilẹ ifihan ifihan kasikedi nipasẹ Janus kinases TYK2 ati JAK15,6.Awọn wọnyi Janus kinases phosphorylate ifihan agbara transducers ati transcriptional amuaradagba activators (STAT1 ati STAT2) lori tyrosine iṣẹku lati pilẹ SH2 domain-ašẹ-mediated heterodimerization6.Lẹhinna, IRF9 sopọ awọn heterodimers STAT lati ṣe eka trimeric kan ti IFN-stimulated factor 3 gene (ISGF3), eyiti o yipada si arin ti o si fa iwe-kikọ ti awọn Jiini ti o ni itara 2000 interferon (ISGs) 5,6,7,8.
Awọn ISG ṣe agbekalẹ ẹhin ti eto ajẹsara abirun, paapaa ni idahun si ikọlu gbogun ti.Gẹgẹbi laini akọkọ ti idaabobo lodi si akoran ọlọjẹ, awọn sẹẹli yarayara ran awọn ibaraẹnisọrọ lọpọlọpọ ti awọn ọlọjẹ cellular pẹlu ọpọlọpọ awọn iṣẹ iṣe ti ibi.Awọn ọlọjẹ wọnyi pẹlu awọn olugba idanimọ apẹẹrẹ, awọn ohun elo ami ifihan, awọn ifosiwewe transcription, ati awọn ọlọjẹ pẹlu awọn iṣẹ antiviral taara, ati awọn olutọsọna odi ti awọn idahun ajẹsara9.Pupọ ti alaye lori iṣẹ ISG wa lati awọn iboju iṣẹ ṣiṣe ni lilo awọn iboju iboju overexpression10,11 tabi awọn ilana ipalọlọ jiini (siRNA, RNAi ati CRISPR) 12,13 ninu eyiti awọn ISG kọọkan ti ṣafihan tabi ni idinamọ ati idanwo iṣẹ wọn lori ọpọlọpọ awọn ọlọjẹ.Botilẹjẹpe awọn ijinlẹ wọnyi ti pinnu awọn ohun-ini antiviral ti awọn ISG kọọkan, awọn ọna ṣiṣe molikula ti ISG kọọkan ko jẹ aimọ pupọju.O gba ni gbogbogbo pe ọpọlọpọ awọn ọlọjẹ n ṣepọ pẹlu ọkan tabi diẹ ẹ sii awọn cytokines lati rii daju iṣẹ ṣiṣe ni kikun, nitorinaa boya awọn ISG ṣe ajọṣepọ taara tabi awọn ibaraenisepo wọn jẹ alaja nipasẹ awọn ọlọjẹ cellular.Fun apẹẹrẹ, kan laipe photocrosslinked proteomics iwadi mọ ATPase VCP/p97 bi pataki kan IFITM3 ibaraenisepo alabaṣepọ, ti idinamọ nyorisi si abawọn ninu lysosomal ayokuro, yipada, ati cotransport ti IFITM3 pẹlu gbogun ti patikulu 14.Lilo imunoprecipitation, a ṣe idanimọ VAPA, amuaradagba ti o ni nkan ṣe pẹlu vesicle, bi alabaṣepọ ibaraenisepo pẹlu IFITM1 / 2/3 ti o ṣe agbedemeji idaabobo awọ-ara ti gbogun ti ogbo, ati pe eyi ni idaniloju nipasẹ iwadi miiran nipa lilo iwukara meji-arabara eto.Atilẹyin Imọ-jinlẹ 15, 16.
Ilana ipilẹ ti ẹkọ ti o ni ipa ninu didapa ikolu ati iyipada buburu jẹ igbejade antijeni, eyiti o jẹ ilaja nipasẹ awọn ohun elo histocompatibility pataki (MHC).Awọn peptides (8-12 amino acids ti o gun) lati fifọ, awọn ọlọjẹ ti o ti pẹ tabi ti kojọpọ ni a kojọpọ sinu MHC-I heterodimer (eyiti o ni MHC-I eru ati awọn ẹwọn ina, ti a npe ni β-2-microglobulin; β2M) 17,18 .Abajade iduroṣinṣin MHC-I trimers ti wa ni gbigbe si oju sẹẹli, nibiti wọn ti ṣafihan peptides intracellular si awọn sẹẹli CD8+ T (awọn sẹẹli T cytotoxic) 17.Awọn sẹẹli T ṣe idanimọ ati pa awọn ọlọjẹ wọnyi run ati awọn sẹẹli ti o ni antijeni kan pato ti tumo.Nitoribẹẹ, pathogens ati awọn sẹẹli tumo nigbagbogbo dinku ilana igbejade antijeni lati yago fun iṣọra ajẹsara.Ni afikun, MHC-I ti wa ni isalẹ ni 40-90% ti awọn èèmọ eniyan ati nigbagbogbo ni nkan ṣe pẹlu asọtẹlẹ talaka19.
Awọn Jiini ti o ni ipa ninu didahun si awọn ọlọjẹ gbọdọ yipada ni iyara laarin ipo isinmi ati ipo iwe-kikọ ti nṣiṣe lọwọ.Nitorina, ọpọlọpọ awọn ọlọjẹ cellular ti wa ni iṣeduro lati ni ipa ninu idahun si ibeere IFN giga lori awọn akoko kukuru, pẹlu atunṣe ati iyipada ti chromatin 20,21 olupolowo.Pupọ awọn ijinlẹ ti dojukọ lori idanimọ ti awọn alabaṣiṣẹpọ amuaradagba ISG kọọkan ni iwaju IFN.Ọpọlọpọ awọn ẹkọ proteomic ati transcriptomic ninu awọn eto sẹẹli awoṣe ti ṣe alaye ipa ti IFN lori ala-ilẹ cellular.Bibẹẹkọ, laibikita oye ti ndagba ti awọn agbara ti o fa nipasẹ interferon, a tun mọ diẹ nipa ikopa ti ISGs.Nigbati o ba ṣe akiyesi idiju ati awọn agbara ti o gbẹkẹle akoko ti ifihan ifihan interferon, awọn ibeere meji dide: (i) Ṣe o ṣee ṣe lati ṣe iduroṣinṣin ati pakute awọn ile-iṣẹ multiprotein ti o wa ninu ami ifihan iyara, ati (ii) Njẹ awọn ibaraenisepo wọnyi le ya aworan si aaye 3D?
Lati koju awọn ọran wọnyi, a ṣe imuse disuccinimide suberate-mediated chemical cross-linking (DSS) papọ pẹlu mass spectrometry (CLMS) lati ṣe iwadi nẹtiwọki ibaraenisepo amuaradagba ti IFNa ati awọn agbara rẹ.DSS ṣafikun awọn ifunmọ covalent laarin awọn iṣẹku isunmọ ti awọn ọlọjẹ ati/tabi awọn eka amuaradagba ni vivo.Onínọmbà MS ti o tẹle ṣe afihan awọn aaye ikorita kan pato ti o ṣe afihan isunmọ aaye ti awọn agbegbe laarin amuaradagba kan pato, ti a pe ni awọn asopọ inu, tabi awọn ipin ninu awọn eka amuaradagba, ti a pe ni awọn ibatan.Lilo ọna yii, a ti ṣe idanimọ ọpọlọpọ awọn eka amuaradagba-amuaradagba aramada bii awọn nẹtiwọọki ibaraenisepo multiprotein ti interferon.Nipa idanwo siwaju si ipin kan ti awọn ibaraenisepo tuntun wọnyi, a ṣe afihan pe H2BFS (H2B histone-type FS; lẹyin eyi tọka si H2B) ati MDN1 ṣe bi awọn alabaṣiṣẹpọ abuda fun HLA-A.
Awọn sẹẹli Flo-1 jẹ ọkan ninu awọn awoṣe vitro ti o mọ julọ ti adenocarcinoma esophageal bi wọn ṣe nfarawe awọn ẹya bọtini ti awọn èèmọ esophageal22,23.Sibẹsibẹ, kii ṣe gbogbo awọn èèmọ jẹ ajẹsara, ati lati pinnu boya awọn sẹẹli Flo-1 dahun si itọju interferon, a ṣe itọju awọn sẹẹli Flo-1 pẹlu 10 ng / ml IFNa fun wakati 72.Awọn sẹẹli Flo-1 ṣe afihan ibẹrẹ ibẹrẹ ti pSTAT1 ati IRF1, bẹrẹ awọn wakati 2 lẹhin itọju ati tẹsiwaju fun awọn wakati 72, pẹlu idinku ti o gbẹkẹle akoko ni awọn ipele iduro ti IRF1 (Figure 1A).ISGs (MX1, IFITM1, OAS1/2, ati ISG15) ni a rii pe o ni ifarasi ti o lagbara lẹhin awọn wakati 6, ti n ṣe apẹẹrẹ aarin Ayebaye ati awọn idahun alakoso ipari si IFNα (Aworan 1A).Papọ, awọn data wọnyi daba pe awoṣe cellular yii le ṣee lo lati ṣe iwadi awọn idahun interferon.
Awọn idahun ikosile amuaradagba iyatọ ni awọn sẹẹli Flo-1 lẹhin itọju IFNa.(A) Amuaradagba ikosile ninu awọn sẹẹli Flo-1 ti a tọju pẹlu 10 ng/ml IFNα fun 2, 6, 24, 48 ati 72 wakati ni a ṣe ayẹwo nipasẹ immunoblot nipa lilo awọn egboogi ISG ti a fihan.(B) Coomassie buluu ti o ni abawọn SDS-PAGE gels ti gbogbo awọn iyọkuro sẹẹli lẹhin ti o ni asopọ agbelebu pẹlu DSS fun awọn akoko itọkasi ati awọn ifọkansi.(C) Aṣoju immunoblot ti a ṣe ayẹwo pẹlu p53 (DO-1) antibody lati awọn ayẹwo kanna lati ṣe ayẹwo iwọn ti ọna asopọ amuaradagba.
Lati gba ala-ilẹ ibaraenisepo amuaradagba ni ipo, a lo DSS, aṣoju ọna asopọ agbelebu ti a lo lọpọlọpọ nitori ayeraye awọ ara ti o ga ati akoko ifasilẹ kukuru.Akoko ifasilẹ kukuru ṣe iranlọwọ lati ṣe idiwọ dida awọn akojọpọ nla ti awọn ọlọjẹ ti o ni asopọ, nitorinaa mimu iduroṣinṣin ti crosslinker.Lati pinnu ifọkansi DSS ti o dara julọ ati yago fun lilọ-kọja, a kọkọ ṣafihan awọn sẹẹli si 5, 2.5, ati 1 mM DSS fun awọn iṣẹju 5, 10, 5, ati 30, ni atele, ati ṣe atupale awọn lysates nipasẹ SDS-PAGE ti Coomassie. (data ko han).Awọn lysates sẹẹli han lati jẹ ọna asopọ agbelebu giga ni ifọkansi ti o kere julọ ati ni aaye akoko kuru ju.Nitoribẹẹ, DSS jẹ titọ si 1, 0.5, ati 0.1 mM ju iṣẹju 5 lọ (Aworan 1B).A ṣe akiyesi agbelebu ti o dara julọ pẹlu 0.5 mM DSS fun awọn iṣẹju 5, ati awọn ipo wọnyi ni a yan fun awọn sẹẹli ti a tọju pẹlu IFNa.Ni afikun, olusin 1C ṣe afihan abawọn Oorun kan ti a ṣe ni lilo atako p53 (DO-1) lati ṣe ayẹwo iwọn isopo-agbelebu amuaradagba.
Awọn sẹẹli Flo-1 ni a tọju pẹlu 10 ng/ml IFNα fun awọn wakati 24 ṣaaju fifi agbelebu.Awọn sẹẹli ti o ni asopọ agbelebu ni atẹle lysed nipasẹ proteolysis-igbesẹ meji ati awọn ọlọjẹ ti ni ilọsiwaju nipasẹ FASP (Fig. 2) 24,25.Awọn peptides tryptic ti a ti sopọ mọ agbelebu ni a ṣe atupale nipasẹ iwọn spectrometry (Fig. 2).Awọn iwoye MS/MS lẹhinna ni ibamu si ọkọọkan amuaradagba ati ni iwọn pẹlu MaxQuant26,27.Awọn peptides ti o ni asopọ agbelebu ni a mọ lati awọn iwoye ti a gba nipa lilo eto SIM-XL, ati pe awọn agbo ogun kọọkan ni a ṣe idapo sinu nẹtiwọọki ti o nipọn nipa lilo xQuest28 ati SIM-XL29 awọn pipeline software iširo orisun (Fig. 2).SIM-XL ṣe idanimọ awọn ibaraẹnisọrọ amuaradagba-amuaradagba, awọn ẹwọn inu ati awọn ẹwọn kọọkan ni awọn akojọpọ amuaradagba ti o rọrun tabi eka ati pese awọn iwe afọwọkọ fun wiwo awọn ibaraẹnisọrọ ni awọn ẹya amuaradagba.Ni afikun, o ṣe ipo itọkasi-agbelebu kọọkan bi Dimegilio ID ni ibamu si didara spectrum MS/MS29.Ọpọlọpọ awọn ibaraenisepo amuaradagba-amuaradagba ti o ni igbẹkẹle pupọ ati awọn eka ti a ti ṣe idanimọ, ati pe a ti ṣe iwadii eto tuntun ti awọn ibaraenisepo nipa lilo ajẹsara-ajẹsara ati awọn iyipada isọdi ti awọn eka nipa lilo awọn adaṣe molikula (MD) awoṣe (Fig. 2) 30, 31.
Sikematiki Akopọ ti CLMS ọna.Awọn sẹẹli Flo-1 ni a ṣe itọju pẹlu 10 ng / ml IFNα fun awọn wakati 24 ti o tẹle nipasẹ isopo-agbelebu amuaradagba situ nipa lilo DSS ti o tẹle nipasẹ lysis sẹẹli ati trypsinization.Awọn ayẹwo ti o ni asopọ agbelebu ni a ṣe atupale nipa lilo iwo-iwoye ibi-nla Orbitrap kan ati pe a ṣe ayẹwo siwaju sii fun pipin awọn ipilẹṣẹ peptide lakoko LC-MS/MS.Awọn peptides meji ti o ni asopọ ni a mọ lati awọn iwoye ti a gba ni lilo Ẹrọ Idanimọ Spectrum ti Eto Awọn Peptides Crosslinked (SIM-XL), ati pe gbogbo awọn agbo ogun ni idapo sinu nẹtiwọọki eka kan nipa lilo awọn opo gigun ti iṣiro.Ṣe àlẹmọ awọn ibaraenisepo igbẹkẹle kekere ti o da lori awọn iye oṣuwọn rere eke (FDR).Ọpọlọpọ awọn ibaraenisepo amuaradagba-amuaradagba giga-giga tuntun ni a ti fi idi mulẹ siwaju sii nipa lilo ajẹsara ajẹsara, ati awọn iyipada isọdi ninu awọn eka naa ni a ṣe ayẹwo nipa lilo awọn adaṣe molikula (MD) awoṣe.
Apapọ ~ 30,500 ati ~ 28,500 peptides ni a rii ni lilo MaxQuant ni awọn ayẹwo IFNa ti ko ni itara ati ti o ni itara, lẹsẹsẹ (Afikun Tabili S1, Fig. 3A).Pipin peptide gigun ni awọn ọran mejeeji fihan ipin ti o ga julọ ti awọn peptides ti o tobi ju, ti o nfihan niwaju peptides ti o ni asopọ agbelebu (Fig. 3B,C).Ni afikun, ipin ti o tobi ju ti awọn peptides ti o tobi ju wa ni iwọn 40-55 ni awọn ayẹwo ti a ṣe itọju IFNa (Fig. 3C).Ṣiṣe aworan amuaradagba lodi si kikankikan log2 fihan pe awọn ọlọjẹ interferon ti o ni itara jẹ lọpọlọpọ julọ ni akawe si awọn ayẹwo ti a ko tọju, pẹlu MX1, IFIT1/3, OAS2/3, DDX58, ati HLA-F (Figure 3D).Itupalẹ awọn ipa ọna fun awọn ọlọjẹ diẹ sii ju ilọpo mẹta ti o ni ilọsiwaju ni idahun si itọju IFNa nipa lilo ibi ipamọ data ipa ọna Reactome fihan pe MHC-I-mediated antigen igbejade ati sisẹ jẹ ọna ti o ga julọ (Nọmba 3E).Ni ibamu pẹlu awọn ijabọ iṣaaju, awọn idahun antiviral ti o ni ilaja nipasẹ OAS ati ISG15 bakanna bi IFNα / β ati ifihan agbara cytokine wa laarin awọn ọna ti a mu ṣiṣẹ.Ni afikun, awọn ọna asopọ agbelebu lysine- ati serine-pato protein-pato ti a damọ lati MS/MS spectra ti a ti gba ni akọkọ nipa lilo SIM-XL.Iwadi kan laipe kan royin awọn ISG 104 ti o ni awọn ọlọjẹ 20 lati awọn kilasi ọlọjẹ 9 nipasẹ itupalẹ-meta ti awọn iwadii apọju ISG kọọkan ni awọn iru sẹẹli 59.Bibẹẹkọ, lati bori awọn idiwọn iširo ti ṣiṣayẹwo awọn ipilẹ data nla, a bẹrẹ pẹlu ipilẹ data kekere lati ṣawari awọn ibaraenisepo ti o ṣeeṣe laarin atokọ ti awọn Jiini IRDS ti a royin nipasẹ Padaria et al., pupọ julọ eyiti o jẹ ISGs.
Idanimọ ti awọn ọlọjẹ ti o ni asopọ agbelebu ti o yatọ si ni idahun si IFNa (data ti a gba lati MaxQuant).(A) Aworan aworan Venn ti o nsoju nọmba ti awọn peptides ti o wọpọ ati iyasọtọ ti a damọ ni IFNα14 ti a tọju ati awọn ayẹwo Flo-1 ti ko ni itọju.Pinpin ipari Peptide ti ko ni itọju (B) ati IFNα ti a ṣe itọju (C) awọn ayẹwo crosslinked.(D) Maapu Ooru ti o nsoju log2 (kikikan LFQ) laarin awọn sẹẹli Flo-1 ti a ko tọju ati IFNα14 ti a tọju.Panel osi fihan awọn ọlọjẹ ti a mu ṣiṣẹ julọ ni iwaju IFNa.(E) Histogram ti o nsoju awọn ọna imudara pataki 20 lẹhin itọju IFNα.Ipilẹ data ipa ọna Reactome ṣe atupale diẹ sii ju awọn iyipada ilọpo mẹrin ninu awọn ọlọjẹ ti idahun IFNa ti a ṣe atunṣe.
Imudara ISG ti interferon ti wa ni akọsilẹ daradara, ṣugbọn ni ipele molikula ko ni oye bi awọn ọlọjẹ wọnyi ṣe pari ni ọpọlọpọ awọn iṣẹ ti ibi.A ṣe iwadii awọn ibaraẹnisọrọ amuaradagba pẹlu iwọn igbẹkẹle giga laarin awọn ISG ti a mọ.O yanilenu, a ṣe idanimọ nẹtiwọki kan pẹlu MX1, USP18, ROBO1, OAS3, ati awọn ọlọjẹ STAT1 ti o ṣe eka nla kan ni idahun si itọju IFNα (Figure 4, Table S2) 32,33,34.Ti o ṣe pataki julọ, awọn ibaraẹnisọrọ wọnyi ni a ri ni gbogbo awọn mẹta ti a ṣe pẹlu IFNa ati pe a ko ri ni awọn ayẹwo ti a ko ni itọju, ni imọran pe a ṣe wọn ni pato ni idahun si itọju IFNa.O mọ pe STAT1 transcriptionally ṣe ilana ikosile ti awọn ISG wọnyi, ṣugbọn ibaraenisepo rẹ pẹlu awọn ISG ni ipele amuaradagba ko ti ṣe iwadi.Ilana gara ti STAT1 fihan pe agbegbe helical rẹ (CCD) ko ni ipa ninu ibaraenisepo pẹlu DNA tabi awọn alamọdaju lakoko dida dimers35.Awọn wọnyi ni α-helices ṣe apẹrẹ helix helical ti o pese agbegbe agbegbe hydrophilic ti o ga julọ fun awọn ibaraẹnisọrọ lati waye 35.Ninu data CLMS wa, a ṣe akiyesi pe pupọ julọ awọn ibaraenisepo pẹlu STAT1 waye ni agbegbe SH2 ti o ṣaju CCD, agbegbe asopọ, tabi iru C-terminal (awọn iyokù 700-708) (Figure 4A).Iwadii iṣaaju ti royin pe USP18 sopọ mọ CCD ati DNA-binding domain (DBD) ti STAT2 ati pe o gba iṣẹ si ipin ti iru I interferon receptor IFNAR2 lati ṣe agbedemeji idinamọ iru I interferon ifihan agbara 24.Awọn data wa tun fihan pe USP18 catalytic domain interacts pẹlu STAT1 DBD (Figure 4A,D), ni iyanju pe mejeeji STAT1 ati STAT2 le ṣe ipa kan ni fifamọra USP18 si IFNAR2.
Amuaradagba-amuaradagba nẹtiwọki ISG ti a damọ ni awọn sẹẹli ti o ni asopọ agbelebu ti a tọju pẹlu IFNa.(A) Idite ibaraenisepo 2D ti n ṣafihan awọn ibaraẹnisọrọ amuaradagba-amuaradagba (ti ipilẹṣẹ ninu eto SIM-XL), pẹlu awọn laini ti o nsoju awọn ibaraenisepo intermolecular (crosslink cutoff ṣeto si 3.5).Awọn ibugbe ti o yatọ si idamo ti wa ni samisi nipasẹ wọn color32: MX1 domain, Dynamin_N (73-249), Dynamin_M (259-547), ati GED (569-660).OAS3 ibugbe: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872), ati OAS1_C (903-108).Ibugbe ROBO1, Ig_3 (67–151), I-ṣeto (170–258), I-ṣeto (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678-758) ati fn3 (777-864).Awọn aaye STAT1: STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657), ati STAT1_TAZ2bind (715–739).(B) Oluwo iyipo ti awọn ọlọjẹ ti o ni asopọ agbelebu (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1, ati STAT1) pẹlu awọn ibaraẹnisọrọ ati awọn ibaraẹnisọrọ ti a samisi ni buluu ati pupa, lẹsẹsẹ.Iba-ọna ọna asopọ agbelebu ti ṣeto ni 3.5.Awọn igbero aami tọkasi awọn aaye ibaraenisepo STAT1 pẹlu MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E), ati OAS3 (F), bakanna bi awọn aaye ibaraenisepo K tabi S laarin awọn peptides meji.Ninu eeya naa, ala-ọna Dimegilio ọna asopọ agbelebu ti ṣeto si 3.0.(G) Awọn aaye ibaraenisepo oriṣiriṣi laarin awọn ibugbe STAT1 ati OAS3 DI ti o da lori awọn ẹya amuaradagba wọn ni PyMol (Eto awọn aworan molikula PyMOL, ẹya 2.0 Schrödinger, LLC.);STAT1 (pdb id: 1bf533) ati OAS3 (pdb id: 4s3n34).) eto.
Awọn isoforms meji ti USP18 ni a ti ṣe apejuwe ninu eniyan, amuaradagba ti o ni kikun ti o wa ni ipilẹ julọ ti o wa ni ipilẹ, ati isoform laisi aaye N-terminal, USP18-sf, eyiti o pin ni deede ni cytoplasm ati nucleus 36.Ni afikun, a ti sọ asọtẹlẹ N-terminus lati jẹ aiṣedeede ati pe ko nilo iṣẹ isopeptidase tabi isọdọmọ ISG1537.Pupọ julọ awọn ibaraenisepo ti a damọ ninu iwadi wa ni o wa ni N-terminus ti amuaradagba, ni iyanju pe awọn ibaraenisepo wọnyi pẹlu USP18 ipari-ipari (Nọmba 4A, D) ati nitorinaa o ṣee ṣe ni aarin.Pẹlupẹlu, data wa tun tọka pe N-terminus jẹ amọja fun awọn ibaraẹnisọrọ amuaradagba-si-amuaradagba.Aaye abuda IFNAR2 wa laarin awọn iṣẹku 312-368, ati paapaa, ko si ọkan ninu awọn ọlọjẹ ti o wa ninu eka asopọ si agbegbe yii (Fig. 4A) 37,38.Awọn data wọnyi ti a mu papọ tọkasi pe agbegbe abuda IFNAR2 jẹ lilo iyasọtọ nipasẹ amuaradagba olugba.Ni afikun, OAS3 ati ROBO1 nikan ni a rii pe o ni nkan ṣe pẹlu awọn ibugbe ni oke ti N-terminus ati aaye abuda IFNAR2 (Figure 4A).
ROBO1 jẹ ti idile imunoglobulin (Ig) superfamily ti awọn ohun elo ifihan agbara transmembrane ati pe o ni awọn ibugbe Ig marun ati awọn ibugbe fibronectin (Fn) mẹta ni agbegbe extracellular.Awọn ibugbe extracellular wọnyi ni atẹle nipasẹ agbegbe membrane-isunmọ ati helix transmembrane kan 39. Agbegbe intracellular ti ko ni ipilẹ ti wa ni aaye C-terminus ati pe o ni awọn ilana itọsi ti o tọju ti o ṣe agbedemeji ipadapọ amuaradagba ipa39.Ekun ti o gbooro lati amino acids ~ 1100 si 1600 jẹ ailera pupọ julọ.A rii pe MX1 ṣe ajọṣepọ pẹlu ROBO1 nipasẹ Ig, Fn, ati awọn ibugbe intracellular, lakoko ti ọpọlọpọ awọn ibaraẹnisọrọ pẹlu STAT1 waye laarin CCD rẹ, agbegbe asopọ, ati C-terminus ti ROBO1 (Fig. 4A, E).Ni apa keji, awọn ibaraẹnisọrọ pẹlu DI, DIII, ati awọn agbegbe asopọ OAS3 ni a pin kaakiri jakejado amuaradagba ROBO1 (Fig. 4A).
Ebi amuaradagba oligoadenylate synthase (OAS) gba ati sopọ RNA (dsRNA) intracellular intracellular double-stranded RNA (dsRNA), ṣe awọn ayipada ti o ni ibamu, ati synthesizes 2′,5′-linked oligoadenylates (2-5 As) 40.A rii pe laarin awọn OAS mẹta, OAS3 ṣe afihan isunmọ ti o ga julọ fun dsRNA ati pe o ṣajọpọ iye ti o kere ju ti 2-5 Bi, eyiti o le mu RNase L ṣiṣẹ ati nitorinaa fi opin si ẹda 41 viral.Idile OAS ni beta polymerase (pol-β) -bi awọn ibugbe gbigbe nucleotide.Iwadi iṣaaju ti fihan pe iṣẹ-ṣiṣe katalitiki ti aaye C-terminal (DIII) dale lori aaye dsRNA-binding (DI), eyiti o nilo fun imuṣiṣẹ ti OAS342.A ṣe akiyesi pe awọn ibugbe DI ati DII ti OAS3 ṣe ajọṣepọ pẹlu CCD ati agbegbe isọpọ kekere laarin SH2 ati STAT1 TAD (Figure 4A,F).Ikọja awọn aaye agbelebu oriṣiriṣi oriṣiriṣi lori eto amuaradagba ṣe afihan ibaraenisepo laarin β-sheet ati DBD STAT1 loop ati apo ṣiṣi tabi iho ti a ṣẹda nipasẹ awọn iyokù 60-75 ni agbegbe DI ti OAS3 (Fig. 4G).Iṣalaye ti awọn ọlọjẹ ti o wa ninu eka naa tun tọka pe ko si ọkan ninu awọn ibaraenisepo pẹlu OAS3 ti o ṣe idiwọ agbara DNA-abuda ti agbegbe DI rẹ (Fig. S1A).Ni afikun, agbegbe N-terminal ti GTPase MX1 ṣe ajọṣepọ pọ pẹlu awọn agbegbe DI ati DIII ti OAS3 (Fig. 4A).A tun ṣe akiyesi ibaraenisepo laarin OAS1 ati MX1 ni gbogbo awọn atunṣe IFNa mẹta ti a ṣe itọju, nibiti agbegbe OAS1 kan (tun n ṣiṣẹ lọwọ) ṣe ajọṣepọ pẹlu gbogbo awọn agbegbe MX1 mẹta (Figure S2A, B).
Awọn ọlọjẹ MX jẹ apakan ti idile nla ti dynein-bi GTPases ti o ni aaye GTPase N-terminal ti o sopọ ati hydrolyzes GTP, agbegbe agbedemeji ti o ṣe agbedemeji apejọ ara ẹni, ati apo idalẹnu leucine C-terminal ti o ṣiṣẹ bi GTPase (LZ) ).ašẹ ipa domain25,43.MX1 sopọ mọ awọn ipin ti awọn polymerases gbogun lati ṣe idiwọ transcription ti gene43 gbogun.Iboju iwukara meji-arabara ti a royin tẹlẹ fihan pe MX1 ti o ni nkan ṣe pẹlu PIAS1 ṣe idiwọ imuṣiṣẹ apilẹṣẹ STAT1-mediated nipa didi iṣẹ ṣiṣe abuda DNA ati tun ni iṣẹ ṣiṣe ligase SUMO E344,45.Nibi, a ṣe afihan pe MX1 sopọ si STAT1 (Nọmba 4C, D), sibẹsibẹ bawo ni ibaraenisepo yii ṣe ni ipa lori STAT1-mediated gene activation ni idahun si IFNa nilo iwadi siwaju sii.Ni afikun, a tun rii pe MX1 ṣe ajọṣepọ pẹlu IFIT3 ati DDX60 ni gbogbo awọn atunṣe IFNa mẹta ti a ṣe atunṣe (Fig. S2C).
DDX60 jẹ helicase cytoplasmic ti o fa IFN ti o ti royin tẹlẹ lati ṣe ipa kan ninu ibajẹ ominira RIG-I ti gbogun ti RNA46.O ṣepọ pẹlu RIG-I ati ki o mu ifihan agbara rẹ ṣiṣẹ ni ọna ligand-pato 46. DDX60 jẹ ti DEXD / H-Box helicase domain ati C-terminal helicase domain ti o so viral RNA ati DNA47.Pupọ julọ awọn ibaraẹnisọrọ rẹ pẹlu MX1 ati IFIT3 waye laarin gigun N- ati awọn agbegbe C-terminal laisi awọn ibugbe canonical tabi awọn motifs (Fig. S2E, F).Sibẹsibẹ, MX1 tun ni nkan ṣe pẹlu DEXD/H-Box helicase domain (Fig. S2E).Awọn ọlọjẹ ti idile IFIT ni awọn adakọ tandem kan ti o yatọ si helix-turn-helix motif ti a pe ni tetrapeptide repeat (TPR).IFIT3 ni a rii pe o jẹ oluyipada rere ti ami ami RIG-I ati nitorinaa paati kan ti eka MAVS.Papọ, data wa daba pe IFIT3 ati DDX60 ṣe ibaraẹnisọrọ ni akọkọ ni agbegbe laarin TPR 3-6 ti IFIT3 ati pe o le ṣe ipa ninu ifihan RIG-I / MAVS (Fig. S2F).
Ni fifunni pe ṣiṣayẹwo gbogbo proteome jẹ aladanla iṣiro, lẹhinna a ṣe ayẹwo gbogbo ibi ipamọ data UniProt eniyan fun wiwa ọkan ninu awọn atunṣe IFNa-ṣe itọju.Ninu ajọra yii, a rii ọpọlọpọ awọn nẹtiwọọki ibaraenisepo igbẹkẹle gaan fun HLA-A.Onínọmbà ti awọn ipa ọna amuaradagba ti a mọ nipasẹ MS/MS spectra fihan pe iṣelọpọ antigen ti o da lori MHC-I ati igbejade jẹ ọna akọkọ ti a fa nipasẹ interferon (Fig. 3D).Nitorinaa, a dojukọ lori kikọ awọn ibaraenisepo amuaradagba ti awọn ohun elo MHC-I pẹlu igbẹkẹle giga ti gbogbo awọn apẹẹrẹ ti o ni asopọ agbelebu.HLA ni awọn ibugbe α1, α2 ati α3 ati awọn ẹwọn ina, ati microglobulin β2 (β2m) jẹ amuaradagba chaperone nigbagbogbo49.Ni kete ti a pejọ ni reticulum endoplasmic, HLA ko ni iduroṣinṣin ni laisi awọn ligands peptide50.Pipa-pipade groove ti wa ni akoso nipasẹ polymorphic ti o ga julọ ati awọn ibugbe α1 ati α2 ti ko ni ipilẹ ni fọọmu ti kii ṣe peptide ati agbegbe α351 polymorphic ti o kere ju.Ni iwaju IFNa, a rii awọn ile-iṣẹ HLA-A meji: ọkan ṣepọ pẹlu HMGA1 ati H2B (Nọmba 5, Table S3) ati ekeji ṣe ajọṣepọ pẹlu MDN1, LRCH4 ati H2B (Figure 6).
IFNa fa nẹtiwọọki ibaraenisepo HLA-A pẹlu H2B (H2BFS) ati HMGA1.(A) Idite 2D (ti ipilẹṣẹ ni sọfitiwia SIM-XL) ti n ṣafihan awọn oriṣiriṣi awọn ibaraenisepo ni eka H2B-HLA-A-HMGA1: interlink (bulu), interlink (pupa) ati ọna asopọ kan (dudu)..Awọn ibugbe ti awọn idamọ oriṣiriṣi jẹ koodu koodu32: H2B (histone; 2–102) ati MHC-I (MHC_1; 25–203, ẹgbẹ C1; 210–290 ati MHC_I_C; 337–364).Iba-ọna ọna asopọ agbelebu ti ṣeto ni 3.5.Awọn igbero aami tọkasi awọn aaye ibaraenisepo HLA-A pẹlu H2B (B) ati HMGA1 (C), bakanna bi awọn aaye ibaraenisepo K tabi S laarin awọn peptides meji.Ninu eeya naa, ala-ọna Dimegilio ọna asopọ agbelebu ti ṣeto si 3.0.(D) Awọn ibatan laarin awọn ọlọjẹ ti o han ni awọn ẹya ti H2B, HLA-A, ati awọn ọlọjẹ HMGA1 ninu eto PyMOL.Awọn ẹya wọnyi jẹ apẹrẹ nipa lilo olupin Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) ati awọn ẹya awoṣe fun awọn ọlọjẹ H2B, HLA-A ati HMGA1 jẹ 1kx552, 1kj349 ati 2eze55, lẹsẹsẹ.
IFNa nfa nẹtiwọki ibaraenisepo HLA-A pẹlu H2B (H2BFS), MDN1 ati LRCH4.(A) Intramolecular (pupa) ati intermolecular (bulu) crosslinks ti a gbekalẹ lori maapu ibaraenisepo 2D (ti ipilẹṣẹ ni sọfitiwia SIM-XL) pẹlu MDN1 ti o jẹ aṣoju bi Circle.Iba-ọna ọna asopọ agbelebu ti ṣeto ni 3.5.Awọn ibugbe ti awọn idamọ oriṣiriṣi jẹ koodu koodu32: H2B (histone; 2–102), MHC-I (MHC_1; 25–203, ẹgbẹ C1; 210–290 ati MHC_I_C; 337–364) ati LRCH4 (LRR_8 (68–126), LRR_8 (137-194) ati CH (535-641)).(B) Awọn ibatan laarin awọn ọlọjẹ ti o han ni awọn ẹya ti H2B, HLA-A, LRCH4, ati awọn ọlọjẹ MDN1 ninu eto PyMOL.A ṣe apẹrẹ awọn ẹya wọnyi ni lilo olupin Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) pẹlu awọn ẹya awoṣe 1kx552, 1kj349, 6hlu62 ati 6i2665 fun H2B, HLA-A, LRCH4 ati awọn ọlọjẹ MDN1, lẹsẹsẹ.Awọn igbero aami ti n ṣafihan awọn aaye ibaraenisepo K tabi S fun HLA-A pẹlu H2B (C), LRCH4 (D), ati MDN1 (E).Fun awọn igbero, ala-ọna Dimegilio ọna asopọ agbelebu ti ṣeto si 3.0.
Ni afikun si mimu iduroṣinṣin ti ẹda-ara, histone H2B tun ṣe alabapin ninu ilana ti transcription.Awọn amuaradagba H2B ni ti aarin histone domain (HFD) ti a ṣẹda nipasẹ awọn α-helices mẹta ti o yapa nipasẹ awọn lupu ati iru C-terminal 41,52.Pupọ julọ ibaraenisepo pẹlu H2B waye ni helix α1, eyiti o pese trimerization pẹlu HFD heterodimer (Fig. 5A,B).Botilẹjẹpe awọn lysins ni ipa ninu sisọ DNA, diẹ ninu awọn lysins tun jẹ acetylation omiiran tabi awọn aaye methylation.Fun apẹẹrẹ, awọn iṣẹku K43, K46, ati K57 lati H2B ko ni ipa ninu isọdọkan DNA taara, ṣugbọn jẹ awọn ibi-afẹde ti ọpọlọpọ awọn iyipada post-transcriptional53.Bakanna, awọn iyokù K44, K47, ati K57 ni H2B le ṣe ipa miiran ni iwaju IFNa, pẹlu awọn ibaraẹnisọrọ pẹlu awọn ọlọjẹ miiran (Fig. 5A, B).Ni afikun, extrachromosomal histone H2B nmu esi ajẹsara ṣiṣẹ ni ọpọlọpọ awọn oriṣi sẹẹli, ṣiṣe bi sensọ cytosolic lati ṣawari awọn ajẹkù DNA ti o ni ilọpo meji (dsDNA) ti o wa lati awọn aṣoju àkóràn tabi awọn sẹẹli ti o bajẹ54.Ni iwaju awọn ọlọjẹ DNA, idinku H2B ṣe idiwọ iṣelọpọ IFN-β ati STAT154 phosphorylation.H2B ni a tun mọ lati gbe sinu ati jade kuro ninu iparun ni iyara ju awọn histones mojuto miiran54.Awọn ibaraẹnisọrọ H2B pẹlu MDN1 ati LRCH4 ni a tun ṣe akiyesi ni awọn ayẹwo ti a ko ni itọju.A rii pe HLA-A ṣe ibaraenisepo pẹlu H2B ni gbogbo awọn ayẹwo IFNa mẹta ti a ṣe itọju ati ninu apẹẹrẹ atunwi kan ti a ko tọju.Awọn data wọnyi ṣe afihan ipa ti H2B ni iṣẹ iṣe adaṣe miiran ti o ni ominira ti ilana transcriptional.
HMGA1 (ẹgbẹ arinbo giga AT-Hook 1), kekere nucleoprotein ọlọrọ ni awọn amino acids igbega arun, ti jẹ idanimọ ni ajọṣepọ pẹlu HLA-A.O ni iru C-terminal ekikan ati awọn DBD mẹta ọtọtọ ti a pe ni awọn kio AT nitori wọn so mọ iho kekere ti agbegbe ọlọrọ AT ni dsDNA55,56.Asopọmọra yii fa DNA lati tẹ tabi taara, gbigba awọn ifosiwewe transcription canonical lati wọle si ọna-afẹde rẹ.Iru C-terminal ni a gbagbọ pe o ni ipa ninu awọn ibaraenisepo amuaradagba-amuaradagba ati igbanisiṣẹ ti awọn ifosiwewe transcription, niwọn igba ti awọn iyipada piparẹ C-terminal ko lagbara lati pilẹṣẹ transcription57.Pẹlupẹlu, agbegbe yii ni ọpọlọpọ awọn aaye phosphorylation ti o tọju ti o jẹ awọn sobusitireti ti a mọ fun kinases 58 .A ṣe akiyesi awọn ibaraenisepo HLA-A ati H2B pẹlu HMGA1 ni ita aaye C-terminal, ni iyanju pe agbegbe C-terminal ni akọkọ ti a lo fun isunmọ ifosiwewe transcription (Fig. 5A, C).Awọn ọlọjẹ HMGA ti njijadu pẹlu histone H1 fun abuda si DNA ohun ti nmu badọgba, nitorina jijẹ iraye si57.Bakanna, o dabi ẹni pe HMGA ṣe ajọṣepọ pẹlu histone H2B lẹgbẹẹ DNA asopọ ni idije pẹlu histone H1.HMGB1 fa ikosile ti HLA-A, -B, ati -C ninu awọn sẹẹli dendritic, ti o yori si imuṣiṣẹ59, ṣugbọn ibaraenisepo laarin HMG ati HLA ko ti royin tẹlẹ.A rii pe HMGA1 ṣe ajọṣepọ pẹlu awọn agbegbe α1 ati α3 ti HLA-A, pẹlu pupọ julọ awọn ibaraenisepo ni ita ti 3 DBD rẹ (Figure 5A,C).Ni ọwọ wa, HLA-A ni a rii pe o wa ni agbegbe ni arin (data ko han), ati fun pe H2B ati HMGA1 tun wa ninu iparun, ibaraenisepo yii le waye ni aarin.Awọn idawọle kan pato ti a wọn laarin H2B, HLA-A, ati HMGA1 jẹ afihan ni olusin 5D.
Pupọ awọn ibaraẹnisọrọ ti HLA-A pẹlu awọn ọlọjẹ miiran waye laarin awọn agbegbe α1 ati α2 rẹ ati agbegbe C-terminal ti o bajẹ (Fig. 6).Ninu ọkan ninu awọn apẹẹrẹ wọnyi, a rii pe HLA-A ṣe ajọṣepọ pẹlu iru rudurudu N-terminal iru ti LRCH4 (Figure 6A,D).LRCH4 ṣe ilana imuṣiṣẹ TLR4 ati fifa irọbi cytokine LPS, nitorinaa ṣiṣatunṣe idahun ajẹsara ajẹsara60,61.O jẹ amuaradagba awo pẹlu mẹsan leucine-rich repeats (LRRs) ati calmodulin (CH) homology motif ninu ectodomain rẹ, atẹle nipasẹ agbegbe transmembrane (TMD) 60, 62.Awọn ibugbe CH ti royin lati ṣe agbedemeji awọn ibaraẹnisọrọ amuaradagba-amuaradagba 60.Na ti o to 300 amino acids laarin awọn ibugbe LRR ati CH jẹ wiwọle diẹ ṣugbọn o ni rudurudu.Da lori iṣẹ ti awọn agbegbe ti o ni rudurudu bi awọn olulaja ti awọn nẹtiwọki amuaradagba-amuaradagba ati gbigbe vesicular 63, a rii pe ọpọlọpọ awọn ibaraẹnisọrọ amuaradagba waye ni awọn agbegbe ti o ni rudurudu.Awọn ibaraenisepo pẹlu MDN1 ni a pin kaakiri jakejado ipari ti amuaradagba, pẹlu LRR1, LRR6, awọn agbegbe CH, ati awọn agbegbe laileto, lakoko ti H2B ti o ni ibatan si agbegbe CH (Fig. 6A, B).Paapaa, ko si ọkan ninu awọn ibaraenisepo pẹlu TMJ, ni iyanju ni pato ti ọna CLMS (Aworan 6A, B).
MDN1 tun ti ṣe idanimọ bi apakan ti nẹtiwọọki amuaradagba HLA-A (Figure 6A).O jẹ ti idile AAA ti awọn ọlọjẹ (ATPases ti o ni nkan ṣe pẹlu awọn iṣẹ oriṣiriṣi).Eyi jẹ agbegbe N-terminal AAA kanna ti o ṣeto sinu oruka hexameric kan ati yọ ifosiwewe apejọ kuro lati 60S 64 ribosomal subunit.han lati wa ni iru si dynein64,65,66.Ni afikun, agbegbe Asp/Glu ọlọrọ ni atẹle nipasẹ aaye MIDAS (ojula ti o gbẹkẹle ion).Nitori iwọn nla ti MDN1 (isunmọ awọn amino acids 5600) ati ilodisi rẹ ti o ni opin pẹlu awọn ọlọjẹ ti a ṣe iwadi daradara, diẹ ni a mọ nipa eto ati iṣẹ rẹ ninu eniyan.A ṣe idanimọ HLA-A, H2B, ati LRCH4 bi awọn alabaṣiṣẹpọ MDN1 ati fi han iṣalaye wọn bi awọn ile-iṣẹ amuaradagba ni PyMol (Fig. 6A, B).Awọn ọlọjẹ mẹtẹẹta wọnyi ṣe ajọṣepọ pẹlu agbegbe AAA, agbegbe asopọ asopọ bi dynein, ati o ṣee ṣe aaye MIDAS MDN1.Ninu ijabọ iṣaaju, isọdi mimọ ti awọn ọlọjẹ bait ṣe idanimọ MDN1 bi amuaradagba ti o ni nkan ṣe pẹlu histone H2B67.Ni afikun, iwadii aipẹ kan tun ṣe ijabọ ibaraenisepo laarin MDN ati HLA-B ninu awọn sẹẹli HCT116 nipa lilo iwoye ibi-iwẹwẹ-iṣọkan, ṣe atilẹyin awọn awari wa68.Idanimọ eka yii ni awọn ayẹwo ti a ṣe itọju IFNa ni imọran ipa kan fun MDN1 ni ifihan agbara interferon.
Nitori awọn Jiini HLA jẹ polymorphic ti o ga julọ, a ṣe jade tito lẹsẹsẹ kika kika HLA-A, -B, ati -C lati data atẹle RNA ti awọn sẹẹli Flo-1 (data ko han).Awọn ilana peptide ti o ni ibamu pẹlu kika atẹle ṣe afihan awọn iyatọ nla laarin HLA-A, -B, ati -C ni awọn agbegbe nibiti awọn peptides ti o sopọ mọ agbelebu wa ni HLA-A (Figure S3).Ni afikun, a ko ṣe akiyesi amuaradagba-si-amuaradagba-agbelebu ti awọn sẹẹli HLA-B/C pẹlu awọn ọlọjẹ H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4.Eyi ni imọran pe ibaraenisepo amuaradagba ti a rii laarin HLA-A, MDN1, LRCH1 ati HMGA1 jẹ pato HLA-A.Ni afikun, itupalẹ proteomic ti awọn ayẹwo ti kii ṣe agbelebu (Table S4) fihan pe HLA-A ni agbegbe ti o ga julọ ni akawe si HLA-B tabi HLA-C.Awọn peptides ti a damọ fun HLA-A ga ni kikankikan ninu mejeeji IFNa-itọju ati awọn ayẹwo ti ko ni itọju.
Lati rii daju pe awọn ibaraenisepo ti a mọ nihin kii ṣe nitori isopo-agbelebu ti kii ṣe pato ti awọn ọlọjẹ meji ni isunmọtosi aaye, a tun jẹrisi awọn ifosiwewe ibaraenisepo HLA-A tuntun meji nipasẹ ṣiṣe awọn igbelewọn ajẹsara ajẹsara.Awọn ibaraenisepo HLA-A pẹlu MDN1 endogenous ati H2B ni a rii ni mejeeji IFNa-itọju ati awọn sẹẹli Flo-1 ti ko ni itọju (Nọmba 7, Nọmba S4).A fi idi rẹ mulẹ pe HLA-A ti mu nipasẹ H2B ni awọn ajẹsara ajẹsara ati pe ẹgbẹ yii jẹ nitori itọju IFNa nitori HLA-A ko si ninu awọn ayẹwo ajẹsara lati awọn sẹẹli ti ko ni itọju (Figure 7A).Sibẹsibẹ, data wa daba pe IFNa ṣe iyatọ ti o ṣe atunṣe HLA-A si H2B ati MDN1.IFNa ṣe ifilọlẹ ajọṣepọ laarin H2B ati HLA-A, ṣugbọn o dinku ajọṣepọ rẹ pẹlu MDN1.A rii pe MDN1 ni nkan ṣe pẹlu HLA-A ni awọn iṣakoso, ati afikun ti IFNa dinku ibaraenisepo yii ni ominira ti induction MDN1 nipasẹ IFNα (Figure 7B, C).Ni afikun, HLA-A imunoprecipitation ti gba H2B ni awọn sẹẹli A549 (Fig. S4), ni iyanju pe ibaraenisepo yii jẹ ominira ti iru sẹẹli.Papọ, awọn abajade wọnyi ṣe atilẹyin awọn ibaraẹnisọrọ interferon-mediated ti HLA-A pẹlu H2B ati MDN1.
HLA-A àjọ-sọ H2B ati MDN1 mọ.Aṣoju endogenous H2B (A) ati MDN1 (B) awọn ajẹsara jẹ ajẹsara lati awọn sẹẹli Flo-1 ti a ṣe itọju IFNa ati ṣe iwadii fun awọn ọlọjẹ ti a tọka.Asin ati ehoro IgG ni a lo bi iṣakoso odi.(C) Awọn iye ibatan (titẹwọle) ti awọn antigens oriṣiriṣi jẹ afihan nipasẹ awọn ajẹsara ti a ṣe iwadii lodi si awọn aporo ara ti a fihan, β-actin ni a lo bi iṣakoso ikojọpọ.
Awọn ohun-ini igbekale ti ọkan ninu awọn nẹtiwọọki ti o ni asopọ agbelebu ti o ni igbẹkẹle ti interferon, H2B-HLA-A-HMGA1, ni a ṣe iwadii.A lo awoṣe awọn agbara agbara molikula gẹgẹbi ọna yiyan lati loye awọn agbara imudara ti awọn ọlọjẹ ti o ni ipa ninu eka yii (Aworan 8).Awọn itọka lati inu data CLMS daba iṣeeṣe ti awọn imudara oriṣiriṣi ti awọn ọlọjẹ H2B, HLA-A, ati HMGA1.Nitorinaa, awọn ile-iṣẹ agbara wọnyi ni a ṣe apẹrẹ ni alabọde olomi: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A, ati H2B-HLA-A-HMGA1.Iboju docking amuaradagba-amuaradagba akọkọ nipa lilo MOE (Ayika Ṣiṣẹ Molecular; Kemikali Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canada) package daba awọn iṣedede ti o ṣeeṣe ti o yatọ laarin awọn ọlọjẹ wọnyi (Fig. 8A).Wiwo ti eka amuaradagba docking ṣe afihan ọpọlọpọ awọn ibaraenisepo ati awọn imudara ti o ṣeeṣe (Aworan 5A, 8).Nitorinaa, isọdi ti o ṣeeṣe kan han ni Nọmba 8A (pẹlu awọn ọna asopọ agbelebu ti a samisi) ati pe o ti ṣe ayẹwo siwaju sii nipa lilo opo gigun ti epo awoṣe MD.Ni afikun, abuda H2B tabi HMGA1 si HLA-A ṣe afihan isunmọ ti o ga julọ ti H2B fun HLA-A (Fig. 8A).
Awọn agbara imudara ti awọn nẹtiwọọki ti o ṣeeṣe laarin awọn eka H2B (H2BFS) -HLA-A, HMGA1-HLA-A, ati awọn eka H2B-HLA-A-HMGA1.(A) Panel osi jẹ maapu 2D (ti ipilẹṣẹ ni sọfitiwia SIM-XL) ti intramolecular (pupa) ati intermolecular (blue) crosslinks (crosslink cutoff set to 3.5).Ni afikun, awọn iṣẹku ọna asopọ agbelebu ti a damọ jẹ aami lori awọn ẹya ti awọn ọlọjẹ H2B, HLA-A, ati HMGA1.Awọn ibamu ti o ni nkan ṣe ti awọn ọlọjẹ wọnyi ni a fa jade ni lilo opo gigun ti epo docking ti a ṣe imuse ninu package MOE.Páńẹ́lì òsì tó wà nísàlẹ̀ ṣàfihàn oríṣiríṣi ìṣèmújáde ti H2B-HLA-A àti àwọn ilé HMGA1-HLA-A pẹ̀lú oríṣiríṣi ọ̀nà àbáwọlé protein-amuaradagba (GBVI/WSA dG; kcal/mol).(B) Iyapa boṣewa (RMSD) ti awọn ipo atomiki (laisi awọn ọta hydrogen) fun eto amuaradagba kọọkan.(C) Awọn ibaraenisepo amuaradagba amuaradagba-amuaradagba hydrogen lati oriṣiriṣi awọn eka idalẹnu ti n ṣakiyesi awọn ibaraenisepo kan pato ti iye akoko ≥ 10 ns.Ijinna gige oluranlọwọ-olugba h-bond ti ṣeto si 3.5 Å, ati pe igun gige oluranlọwọ-H-olugba ti ṣeto si ≥ 160°–180°.DAwọn ẹya amuaradagba ṣe aṣoju ọna aropin ti 100 ns MDS.(E) Awọn ibaraenisepo laarin awọn ile-iṣẹ HLA-A-H2B ati HLA-A-HMGA1 ni akawe si awọn ibaraenisepo ti a tọpa nipasẹ simulation H2B-HLA lori 100 ns ti o da lori aaye ibaraenisepo K tabi S laarin awọn peptides meji.awọn eka / HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.Iwọn ala-ilẹ fun igbelewọn awọn ọna asopọ-agbelebu ti ṣeto si 3.0, ati awọn ibaraenisepo kan pato lati MDS mu ≥ 10 ns ni a ṣe akiyesi.Awọn ẹya Amuaradagba ni a wo ni lilo BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, USA) ati Ayika Ṣiṣẹ Molecular (MOE; Kemikali Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canada) awọn idii.
Iduroṣinṣin ti awọn ohun elo HLA-A ni akoko pupọ (iyapa boṣewa; RMSD tabi iyapa boṣewa; RMSF) tọkasi pe wiwa H2B tabi awọn ọlọjẹ HMGA1 ninu awọn eka ti duro HLA-A (Nọmba 8B, Nọmba S5).Awọn amuaradagba HMGA1 sopọ mọ ni wiwọ si aaye B2M ti HLA-A, nfa iduroṣinṣin ti awọn amino acids HLA-A ni eka HLA-A-HMGA1 tabi H2B-HLA-A-HMGA1 (Aworan 8B, Nọmba S5).ni pato, awọn iṣẹku HLA ~ 60-90 ati ~ 180-210 ni a ri pe ko ni rọ ni iwaju H2B (FIG. 8B).H2B ati HMGA1 ṣe afihan abuda to dara julọ si HLA-A ni eka H2B-HLA-A-HMGA1 ni akawe si HLA-A abuda si H2B tabi HMGA1 nikan (Aworan 8C,D; Tabili S5).Awọn iyokù ti o ni ipa ninu isunmọ hydrogen (MD ti a ṣe apẹrẹ ibugbe giga ≥ 10 ns) ṣe deede pẹlu awọn aaye ibaraenisepo CLMS (K tabi awọn iyokù S) ninu eka naa, ni iyanju pe awọn ibaraenisepo ti CLMS ṣe idanimọ jẹ igbẹkẹle pupọ.Igbẹkẹle (Fig. 8E).Ni CLMS ati awoṣe MD, awọn iṣẹku HLA-A laarin bii 190-210 ati nipa 200-220 amino acids ni a rii lati di H2B ati HMGA1, lẹsẹsẹ (FIG. 8E).
Awọn ibaraenisepo amuaradagba-amuaradagba ṣe awọn nẹtiwọọki igbekalẹ ti o ni agbara ti o ṣe agbedemeji ibaraẹnisọrọ intracellular ni idahun si awọn iyanju kan.Nitoripe ọpọlọpọ awọn isunmọ proteomics ṣe awari awọn iyipada ni ipele iduroṣinṣin gbogbogbo ti amuaradagba, awọn agbara ibaraenisepo amuaradagba-amuaradagba nilo awọn irinṣẹ afikun lati mu awọn atọkun abuda, ati CLMS jẹ ọkan iru irinṣẹ.Eto isamisi interferon jẹ nẹtiwọọki cytokine ti o fun laaye awọn sẹẹli lati dahun si ọpọlọpọ awọn ami-ifunni-ara ayika ati awọn ami aarun inu, ti o pari ni ifakalẹ ti awọn ipin ti awọn ọlọjẹ interferon-inducible.A lo CLMS lati pinnu boya awọn ibaraenisepo amuaradagba-amuaradagba tuntun le ṣe idanimọ laarin igbimọ ti awọn ọlọjẹ ti o fa interferon.Atupalẹ ọna asopọ agbekọja amuaradagba agbaye ni awoṣe sẹẹli Flo-1 idahun interferon ni a lo lati mu awọn eka amuaradagba.Iyọkuro awọn peptides tryptic lati awọn sẹẹli ti kii ṣe agbelebu ati awọn sẹẹli ti o sopọ mọ agbelebu ngbanilaaye fun kika peptide, imudara ipa ọna, ati pinpin gigun peptide pẹlu asọye LFQ kikankikan.Awọn ọlọjẹ interferon-inducible Canonical ni a mọ bi iṣakoso inu inu rere, lakoko ti a ṣe akiyesi intermolecular tuntun ati awọn agbekọja intramolecular ti awọn ọlọjẹ interferon-inducible bi MX1, UP18, OAS3 ati STAT1.Orisirisi awọn ẹya ara ẹrọ ati awọn ibaraenisepo ni awọn agbegbe iṣẹ ni a ti ṣe iwadii.
Ibaraṣepọ laarin HLA-A, MDN1 ati H2B ni a rii nipasẹ imunoblotting ni awọn sẹẹli Flo-1 ati A549 ti a tọju ati ti ko ni itọju pẹlu IFNa.Awọn abajade wa ṣe afihan pe awọn eka HLA-A pẹlu H2B ni ọna ti o gbẹkẹle IFNa.Iṣẹ wa ṣe aṣoju ọna ti o nifẹ fun iwadii siwaju si ti isọdọkan agbegbe ti awọn eka meji wọnyi.Yoo tun jẹ ohun ti o nifẹ lati faagun ọna CLMS si nronu ti awọn laini sẹẹli lati ṣe idanimọ awọn ibaraenisepo amuaradagba interferon-ominira iru sẹẹli.Nikẹhin, a lo awoṣe MD gẹgẹbi ọna yiyan lati loye awọn agbara imudara ti awọn ọlọjẹ ti o ni ipa ninu eka H2BFS-HLA-A-HMGA1, eyiti o tọpa intramolecular ati awọn ọrọ-agbelebu intermolecular.Awọn itọka lati inu data CLMS daba iṣeeṣe ti awọn imudara oriṣiriṣi ti awọn ọlọjẹ H2BFS, HLA-A, ati HMGA1.Awọn ibaramu oriṣiriṣi ti o ṣeeṣe laarin awọn eka amuaradagba docking wọnyi ṣafihan ọpọlọpọ awọn ibaraenisepo ti o jọra si awọn ti a ṣakiyesi ninu data CLMS.Ọkan ninu awọn agbara akọkọ ti ọna wa ni pe o ngbanilaaye idanimọ irọrun ti ibaraenisepo awọn jiini polymorphic giga gẹgẹbi HLA, nitorinaa yoo jẹ ohun ti o nifẹ lati ṣe iwadi awọn ibaraenisepo ti awọn ọlọjẹ-pato HLA haplotype ti bibẹẹkọ o ṣoro lati kawe.Papọ, data wa ṣe afihan pe a le lo CLMS lati faagun oye wa ti awọn nẹtiwọọki ifihan ti interferon ati pese ipilẹ fun kikọ ẹkọ awọn ọna ṣiṣe intercellular ti o nipọn diẹ sii ni microenvironment tumor.
Awọn sẹẹli Flo-1 ni a gba lati ATCC ati ṣetọju ni DMEM (Gibco) ti o ni afikun pẹlu 1% penicillin / streptomycin (Invitrogen), 10% oyun bovine serum (Gibco) ati ti o fipamọ ni 37 ° C ati 5% CO2.Imudaniloju.Awọn sẹẹli ti dagba si 70-80% confluence ṣaaju ki o to ni itọju pẹlu IFNα14 (ti a ṣe nipasẹ Edinburgh Protein Production Facility).Gbogbo awọn kemikali miiran ati awọn reagents ni a ra lati Sigma Aldrich ayafi bibẹẹkọ ṣe akiyesi.
Awọn sẹẹli Flo-1 ni a gbin ni awọn apẹrẹ 6-daradara ati ni ọjọ keji awọn sẹẹli naa ni a tọju pẹlu 10 ng/ml IFNα14 fun awọn wakati 24 si isunmọ 80% confluence.Awọn sẹẹli ni a fọ ​​ni igba mẹta pẹlu PBS ati pe o ni ibamu pẹlu DSS tuntun ti a pese silẹ (Thermo Fisher Scientific) (tituka ni DMSO) ni PBS fun 5 min ni 37 ° C. si ifọkansi ikẹhin ti 0.5 mM.Idahun irekọja DSS ti rọpo pẹlu PBS ati pe DSS ti o ku ni a pa nipa fifi 20 mM Tris (pH 8.0) kun ni PBS fun iṣẹju 15 ni 37°C.Awọn sẹẹli ni a gba nipasẹ fifa ati gbigba ni awọn tubes abuda kekere (Axygen).
Pellet sẹẹli naa jẹ lysed pẹlu 300 µl ti ifipamọ urea lysis (8 M urea, 0.1 M Tris, pH 8.5) fun awọn iṣẹju 30 ni iwọn otutu yara pẹlu gbigbọn lẹẹkọọkan.Gbogbo awọn igbesẹ centrifugation ni a ṣe ni 14,000 xg ni 8°C.Centrifuge awọn lysate fun iṣẹju mẹwa 10 ki o gbe supernatant lọ si tube tuntun kan.Awọn patikulu mimọ to ku ni a tuka ni 150 μl ti ifipamọ lysis keji (2 M urea, 2% (w/v) SDS (sodium dodecyl sulfate)) fun awọn iṣẹju 30 tabi diẹ sii titi ti ojutu olomi isokan ti gba.Awọn lysate ti a centrifuged fun 20 iṣẹju ati awọn supernatant ti a adalu pẹlu awọn lysate gba ni išaaju igbese.Awọn ifọkansi Amuaradagba ni a ṣe ayẹwo ni lilo iṣiro Micro BCA (Thermo Fisher Scientific) ni ibamu si awọn ilana olupese fun awọn ilana microplate.Awọn ayẹwo ni a yara ni didi ni nitrogen olomi ati ti o fipamọ ni -80°C.
O fẹrẹ to 100 μg ti amuaradagba ti o ni asopọ agbelebu ti a ṣe ilana ni lilo ilana igbaradi sisẹ ti a ti yipada (FASP) gẹgẹbi a ti ṣalaye nipasẹ Wisniewski et al.69 Ni soki, amuaradagba jẹ ọna asopọ pẹlu 200 µl ti urea buffer (8 M urea ni 0.1 M Tris, pH 8.5), vortexed ati idaji.Gbogbo awọn igbesẹ centrifugation ni a ṣe ni 14,000 xg ni 25°C.Idaji akọkọ ti lysate amuaradagba ti o ni asopọ agbelebu ti gbe lọ si 10 kDa Microcon centrifugal filter filter ti o ni ipese pẹlu awọ-ara Ultracel-10 (Merck), atẹle nipa centrifugation lori àlẹmọ fun awọn iṣẹju 25.Lẹhinna ṣafikun idaji keji ti amuaradagba si àlẹmọ ki o tun ṣe awọn igbesẹ kanna.Amuaradagba imularada ti a ṣe nipasẹ fifi 100 μl ti 17 mM tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) ni ifipamọ urea.Imularada ti ru soke lori thermomixer ni 600 rpm fun awọn iṣẹju 30 ni 37 ° C.Ni afikun, ọwọn naa jẹ centrifuged ati pe amuaradagba ti o ni asopọ agbelebu ti o dinku jẹ alkylated nipa lilo 100 μl ti 50 mM iodoacetamide ni ifipamọ urea.Idahun alkylation ni a ṣe ni iwọn otutu yara fun iṣẹju 20 ninu okunkun.Yi ọwọn naa, wẹ awọn odi ọwọn ni igba 3 pẹlu 100 µl urea buffer, ati lẹhinna centrifuge.Išišẹ kanna ni a ṣe ni igba mẹta ni lilo 100 μl ti 100 mM ammonium bicarbonate.Ṣaaju ki o to trypsinization, rọpo tube gbigba pẹlu titun kan.Ṣafikun idalẹnu tito nkan lẹsẹsẹ ti o ni 50 mM ammonium bicarbonate ati 1 µl trypsin ti a fomi po ninu saarin trypsin (Promega).Ipin ti trypsin si amuaradagba ni a tọju ni iwọn 1:33, ati awọn aati tito nkan lẹsẹsẹ jẹ idawọle ni alẹ kan ni 37° C. ni iyẹwu ọririn kan.Awọn peptide crosslink ti yọ kuro lati àlẹmọ nipasẹ centrifugation fun awọn iṣẹju 25.Imularada Peptide ti ni ilọsiwaju nipasẹ fifi 50 μl ti 0.5 M NaCl kun si àlẹmọ, atẹle nipa centrifugation fun awọn iṣẹju 25.
Awọn ọwọn C18 Micro Spin (Harvard Apparatus) ni a lo lati sọ awọn peptides tryptic ti o ni asopọ agbelebu ni atẹle ilana ti a ṣalaye nipasẹ Bouchal et al.70 pẹlu awọn iyipada kekere.Ni ṣoki, awọn ọwọn iyipo C18 ti mu ṣiṣẹ pẹlu awọn fifọ mẹta ti 0.1% formic acid (FA) ni acetonitrile (AcN) (Merck) ati awọn fifọ meji ti 0.1% FA.Awọn ọwọn ti a omi pẹlu 0,1% FA 15 iṣẹju.Fi awọn ayẹwo sinu awọn ọwọn alayipo ati wẹ awọn akoko 3 pẹlu 0.1% FA.Awọn peptides desalted ti wa ni tito-tẹẹrẹ eluted pẹlu itọsẹ-igbesẹ ni lilo 50%, 80% ati 100% AcN ni 0.1% FA.A ti gbẹ awọn ayẹwo ni SpeedVac Plus concentrator (Eppendorf) titi ti omi to ku patapata parẹ.Awọn peptides eluted ti tuka ni 100 μl ti 0.08% trifluoroacetic acid ni 2.5% AcN ati awọn ifọkansi ti wọn lori NanoDrop 2000 (Thermo Scientific).Ni isunmọ 1 μg ti peptide crosslinked fun ayẹwo ni a itasi sinu eto LC-MS/MS.
Awọn peptides ti o sopọ mọ agbelebu ni a yapa lori eto UltiMate 3000 RSLCnano LC (Thermo Scientific) ti a ti sopọ si Orbitrap Exploris 480 mass spectrometer (Thermo Scientific).Awọn peptides ti o sopọ mọ agbelebu ni a gba lori ID 300 µm kan, 5 mm gigun µ-tẹlẹ-iwe C18 iwe gbigba ti o kun pẹlu C18 PepMap100 sorbent ati 5 µm PepMap sorbent (Thermo Scientific).Gbe ṣiṣan fifa soke ti a ṣeto ni 5 µl/min 0.08% trifluoroacetic acid tituka ni 2.5% AcN.Awọn peptides ti o ni asopọ agbelebu ni a ya sọtọ lori iwe siliki ti o dapọ itupalẹ pẹlu iwọn ila opin ti 75 μm ati ipari ti 150 mm, ti o kun fun 2 μm PepMap sorbent (Thermo Scientific).Awọn ipele alagbeka A ati B jẹ 0.1% FA ninu omi ati 0.1% FA ni acetonitrile, lẹsẹsẹ.Atẹle naa bẹrẹ ni 2.5% B ati pe o pọ si laini si 40% B ju iṣẹju 90 lọ, lẹhinna si 90% B ni iṣẹju 2 to nbọ.Iṣakojọpọ alakoso alagbeka jẹ itọju ni 90% B fun awọn iṣẹju 10 ati lẹhinna dinku laini si 2.5% B ju iṣẹju meji lọ.Awọn ọwọn naa jẹ iwọntunwọnsi ni 2.5% B fun awọn iṣẹju 8 ṣaaju ọmọ atẹle.Awọn peptides ti o ni asopọ agbelebu yọ kuro lati inu iwe analitikali ni ionized ni orisun nanoelectrospray ionization (NSI) ati itasi sinu Exploris 480 mass spectrometer (Thermo Scientific).
Orbitrap Exploris 480 mass spectrometer ṣiṣẹ ni ipo ibamu data rere.Ayẹwo kikun ni a ṣe ni ipo apakan ni ipinnu ti 120,000 pẹlu awọn eto sakani lati m/z 350 Th si m/z 2000 Th.Aṣeto ibi-afẹde AGC deede ni 300% pẹlu akoko titẹ sii ti o pọju ti 50ms.Wiwa tente oke monoisotopic ti jẹ idasilẹ fun awọn peptides.Paramita isinmi ihamọ ti ṣeto si otitọ ti o ba rii awọn iṣaju diẹ ju.Agbara ionic ti o kere ju ti iṣaju ti ṣeto si 5.0e3 ati awọn ipinlẹ idiyele iṣaaju ti o to +8 wa ninu awọn idanwo naa.
Akoko iyipo laarin awọn iwoye pataki ni ipo ibamu data ti ṣeto si awọn aaya 2.5.Iyasọtọ pipọ ti o ni agbara ti ṣeto si 20 s lẹhin pipin akọkọ ti ion ṣaaju.Ferese ipinya iṣaju ti ṣeto si 2 Th.Iru agbara ijamba deede pẹlu ipo agbara ijamba ti o wa titi ni a yan ninu ọlọjẹ MS/MS ti o gbẹkẹle data.Agbara ijamba ṣeto si 30%.A ṣeto ipinnu Orbitrap si 15,000 ati ibi-afẹde AGC si 100%.Akoko abẹrẹ ti o pọju ti aṣa ti ṣeto si 60 milliseconds.
Ṣaaju ki o to ṣe atẹle nẹtiwọọki amuaradagba-amuaradagba ni awọn ayẹwo ti o sopọ mọ agbelebu, a ṣe ilana awọn faili aise nipa lilo package MaxQuant (ẹya 1.6.12.0) 26,27 lati ṣe idanimọ awọn peptides / awọn ọlọjẹ ti o wa ninu awọn ayẹwo.Ni afikun, awọn itupale proteomic ti o jọra ni a ṣe lori awọn ayẹwo Flo-1 ti ko ni ibatan ti a tọju ati ti ko ni itọju pẹlu IFNa.Awọn data MS/MS ni a wa ninu UniProt data data eniyan (www.uniprot.org) (ti a gbejade ni Oṣu Kẹjọ Ọjọ 12, Ọdun 2020, ni awọn titẹ sii 75,093 ninu) ni lilo ẹrọ wiwa ti a ṣe sinu Andromeda27.Iwadi naa ni a ṣe laisi afihan pato ti enzymu ati awọn iyipada ti o yatọ ti deamidation (N, Q) ati oxidation (M).Awọn ifarada ibi-iṣaaju ti ṣeto ni 20 ppm ati awọn ions ọja ni 0.02 Da.Ipilẹṣẹ ati iyapa ti o pọju ti ṣeto si 10 ppm.Iwọn ti peptide ti o pọ julọ ti ṣeto ni 4600 Da ati pe a ṣeto ibajọra ọkọọkan laarin 7 ati 25 amino acids (aa).Awọn iṣiro iṣiro siwaju sii ni a ṣe pẹlu lilo eto Perseus (ẹya 1.6.10.45).A ṣe iṣiro akoonu amuaradagba nipasẹ ṣiṣe deede kikankikan iwoye ti amuaradagba (kikikan LFQ; titobi ti ko ni aami)27 ati awọn iye kikankikan ti yipada si Log2.Iṣijọpọ akosoagbasomode ti awọn ọlọjẹ ti a damọ nipasẹ kikankikan peptide wọn ni a kọ nipa lilo package pheatmap (v1.0.12) ni R (v 4.1.2).Ayẹwo imudara ipa ọna ni a ṣe ni lilo data data data Reactome fun awọn ọlọjẹ ti a ṣe itọju IFNa ti o ju igba mẹrin ṣiṣẹ ni akawe si awọn ayẹwo ti a ko tọju.
Idanimọ ti lysine (K) tabi serine (S) awọn ọna asopọ kemikali kan pato ti awọn eka amuaradagba ti a ṣe abojuto nipasẹ LC-MS/MS ni a ṣe pẹlu lilo ẹrọ idanimọ spectroscopic (SIM-XL) fun awọn peptides ti o ni asopọ agbelebu (SIM-XL) 29.Ni akọkọ, awọn ibaraẹnisọrọ ti o ṣeeṣe laarin interferon-associated (IFN) DNA ibaje resistance Ibuwọlu (IRDS) awọn Jiini ni a ṣe iwadi nipa lilo data data amuaradagba IRDS ti a ṣalaye ninu Padariya et al.28.Ṣiṣayẹwo gbogbo awọn ipo ati atunwi ti gbogbo UniProt eniyan jẹ aladanla iṣiro, nitorinaa gbogbo data data UniProt eniyan (www.uniprot.org) (ṣe igbasilẹ 12 August 2020, ni awọn titẹ sii 75,093) ni ilodi si awọn atunṣe IFNa-mu.Ọkan ninu awọn asẹ fun awọn ibaraẹnisọrọ igbẹkẹle giga.Awọn ibaraenisepo pataki-giga wọnyi ti o gba ni a gbooro ati idanwo ni gbogbo awọn atunwi ati awọn ipo.
Ni SIM-XL, DSS ti lo fun crosslinker (XL) ati iyipada iwuwo XL ati iyipada iwuwo ti a ṣeto si 138.06 ati 156.07, lẹsẹsẹ.Awọn aaye ifasilẹ ọna asopọ atẹle wọnyi ni a gbero: KK, KS ati KN-TERM, laisi awọn ions onirohin.Mejeeji ṣaaju ati ppm ajẹkù ni a ṣeto si 20 ati pe a ṣeto iloro Xrea si 0.15.Trypsin ni a ka pe o jẹ pato pato, ati pe a ti ṣe imuse ọna pipin agbara C-trap (HCD).Idinku idinku XCorr DB ti o ni agbara ati nọmba ti o kere julọ ti awọn peptides fun idinku DB ti o ni agbara ni a ṣeto si 2.5 ati 2, lẹsẹsẹ.Awọn paramita miiran jẹ: iṣeeṣe monoisotope ati gige ijamba ijamba, o kere ju 4 AA iṣẹku fun okun ati idiyele okun ti o pọju, ati 3 maxima ti awọn pipin ti o padanu.Abajade awọn maapu 2D din ni a ṣe atupale ni (SIM-XL) ati pe aṣoju ayaworan xQuest28 ni a lo lati kọ awọn maapu 2D naa.Amuaradagba crosslinks lori amuaradagba ẹya ti wa ni pese ni PyMol (PyMOL Molecular Graphics System, version 2.0 Schrödinger, LLC).
Awọn ẹya awoṣe Amuaradagba ni a ṣẹda nipa lilo olupin Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 ni lilo awọn ilana ti awoṣe homology ati imuse ti “Ọna Markov Farasin”.Phyre2 n ṣe agbekalẹ awọn ẹya awoṣe ti o da lori titete ọkọọkan pẹlu awọn ẹya amuaradagba ti a mọ.Fun H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4, ati awọn ọlọjẹ MDN1, awọn ẹya awoṣe 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62, ati 6i2665 ni a lo.Ni afikun, eto AlphaFold71 MX1, UBP18 ati ROBO1 ni a tun gbero.Eto amuaradagba naa ni wiwo ni lilo BIOVIA Discovery Studio Visualizer package (Dassault Systèmes, BIOVIA, San Diego, CA, USA) ati package Ayika Ṣiṣẹ Molecular (MOE; Group Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Canada).