310 10 * 1mm Irin alagbara, irin coiled tubing paati kemikali, Awọn ibugbe N-terminal ti spidroin fọọmu hydrogels ti o da lori awọn fibrils amyloid ati pese aaye kan fun aibikita amuaradagba.

O ṣeun fun lilo si Nature.com.O nlo ẹya ẹrọ aṣawakiri kan pẹlu atilẹyin CSS lopin.Fun iriri ti o dara julọ, a ṣeduro pe ki o lo ẹrọ aṣawakiri imudojuiwọn kan (tabi mu Ipo Ibamu ṣiṣẹ ni Internet Explorer).Ni afikun, lati rii daju atilẹyin ti nlọ lọwọ, a fihan aaye naa laisi awọn aza ati JavaScript.
Sliders nfihan awọn nkan mẹta fun ifaworanhan.Lo awọn ẹhin ati awọn bọtini atẹle lati gbe nipasẹ awọn ifaworanhan, tabi awọn bọtini idari ifaworanhan ni ipari lati gbe nipasẹ ifaworanhan kọọkan.

Sipesifikesonu

310 10 * 1mm Irin alagbara, irin coiled ọpọn awọn olupese

Kemikali Tiwqn

Darí Properties

Awọn ọlọjẹ siliki Spider Recombinant (awọn ọlọjẹ siliki Spider) ni ọpọlọpọ awọn ohun elo ti o ni agbara ni idagbasoke awọn ohun elo biomaterials tuntun, ṣugbọn multimodal wọn ati iseda-iṣoro-ajọpọ jẹ ki wọn nira lati gba ati rọrun lati lo.Nibi ti a jabo pe recombinant kekere spidroin awọn ọlọjẹ ati, pataki, awọn N-terminal domain (NT) ara nyara dagba ara-atilẹyin ati sihin hydrogels ni 37 °C.awọn ọlọjẹ idapọ ti o ni NT ati amuaradagba Fuluorisenti alawọ ewe tabi purine nucleoside phosphorylase ṣe fọọmu awọn ọlọjẹ idapọ ti iṣẹ ni kikun.Awọn Hydrogels.Awọn abajade wa fihan pe NT recombinant ati awọn ọlọjẹ idapọ pese awọn ikore ikosile giga ati fifun awọn hydrogels pẹlu awọn ohun-ini ti o wuyi gẹgẹbi akoyawo, gelation laisi agbelebu, ati aibikita taara ti awọn ọlọjẹ lọwọ ni iwuwo giga.
Awọn alantakun ni ọpọlọpọ bi awọn oriṣiriṣi oriṣiriṣi meje ti awọn keekeke siliki, ọkọọkan n ṣe iru siliki kan pato.Gbogbo awọn ẹya siliki meje ni awọn ọlọjẹ siliki alantakun (spidroins) to iwọn 6000 awọn iṣẹku gigun ati ni agbegbe atunwi aarin nla ti yika nipasẹ awọn agbegbe N- ati C-terminal (NT ati CT) 1,2.Iru siliki ti a ṣe iwadi julọ julọ, ampulla akọkọ, jẹ iṣelọpọ nipasẹ ẹṣẹ ampulla akọkọ.Ninu ẹṣẹ yii, monolayer ti awọn sẹẹli epithelial ṣe idapọ awọn ọlọjẹ spidroin ati ki o fi wọn pamọ sinu lumen ti ẹṣẹ, nibiti wọn wa ni fọọmu ti o yanju (doping) ni awọn ifọkansi giga pupọ (30-50% w / v) 3,4.Eto ati ibaramu ti awọn ọlọjẹ spidroin ampullar akọkọ ninu ẹṣẹ jẹ ariyanjiyan, ṣugbọn ọpọlọpọ ẹri esiperimenta tọkasi wiwa helical gbogbogbo ati/tabi isọdọtun helical laileto ati awọn ẹya micellar tabi lamellar5,6,7,8,9,10.Lakoko ti awọn ibugbe atunwi ṣe ilana awọn ohun-ini ẹrọ ti awọn okun siliki, ṣiṣe awọn nanocrystals β-sheet ati awọn ẹya amorphous11,12,13,14,15, awọn ibugbe ipari n ṣe ilana awọn okun siliki ni idahun si awọn ipo iyipada pẹlu gland siliki16,17,18.Nipa ṣiṣakoso dida siliki, 19. Awọn ibugbe ebute ti wa ni ipamọ itankalẹ ati iṣẹ wọn le jẹ wọpọ si gbogbo awọn ọlọjẹ spidroin 2,20,21.Lakoko gbigbe nipasẹ ẹṣẹ, pH ti spidroin dinku lati bii 7.6 si <5.716 ati pe o pọ si pẹlu irẹrun ati na ni ilaja nipasẹ gbigbe nipasẹ ọna ti n dín diẹdiẹ.Ni ojutu, CT jẹ ẹya α-helical constitutive parallel dimer17, ṣugbọn ni idahun si pH kekere ati awọn agbara irẹwẹsi, CT n ṣii ati yipada β-layers16, 17, o ṣee ṣe nfa awọn β-layers ni awọn agbegbe ti o tun pada ti Iyipada 16. NT jẹ monomeric labẹ awọn ipo ti n ṣe afihan awọn ipo ni lumen ti ẹṣẹ ati ki o ṣe agbedemeji solubility ti spidroin, ṣugbọn ni pH ti o dinku, protonation ti nọmba kan ti awọn ẹwọn ẹgbẹ carboxylic acid yori si dimerization ti NT pẹlu pKa kan ti o to 6.5, nitorinaa imuduro NT ati atunse spidroin ni titobi nla. titobi.awọn nẹtiwọki 16,18.Nitorinaa, NT ṣe ipa pataki ninu dida filamenti, iyipada lati monomer ninu ibora si dimer ninu fiber23,24,25.NT si maa wa ni tiotuka ati helical labẹ gbogbo awọn ipo ti a ṣe iwadi titi di ọjọ16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29, eyiti o ṣe atilẹyin idagbasoke rẹ gẹgẹbi aami imudara-solubility fun iṣelọpọ awọn ọlọjẹ heterologous.
Recombinant mini Spider siliki amuaradagba, wa ninu ti ọkan NT, ọkan kukuru tun ekun, ọkan CT, ati ki o kan His6 tag (Re-NT2RepCT) fun ìwẹnumọ, jẹ bi tiotuka ni olomi saarin bi abinibi Spider siliki amuaradagba ati ki o mimics abinibi pataki abuda kan ti siliki Spider. .agbegbe 25.31.His-NT2RepCT le ti wa ni yiri sinu lemọlemọfún awọn okun lilo a biomimetic ẹrọ ninu eyi ti a pH 8 tiotuka ti a bo ti wa ni extruded sinu kan pH 525,32,33,34,35 omi iwẹ.Bioreactor bakteria ti E. coli n ṣalaye Rẹ-NT2RepCT ati itọju lẹhin-itọju yorisi> 14 g/L ikore lẹhin isọdimimọ.Ikore giga, solubility giga, ati esi deedee ti His-NT2RepCT si awọn ipo ekikan ni gbogbo wọn jẹ si NT23, 25, 34.
Nibi a ṣe ijabọ didasilẹ iyara ti awọn hydrogels sihin lati awọn ọlọjẹ spidroin recombinant, pẹlu NT nikan, nipa sisọ ojutu amuaradagba ni 37 °C.Lilo thioflavin T fluorescence (ThT), Fourier yipada infurarẹẹdi spectroscopy (FTIR), iparun oofa resonance spectroscopy (NMR) ati gbigbe elekitironi microscopy (TEM), a ri pe NT ati microspider awọn ọlọjẹ faragba iyipada igbekale sinu β-sheets ati amyloid-bi fibrils. nigbati awọn gels ti wa ni akoso.Ni afikun, awọn ọlọjẹ idapọ ti NT ati amuaradagba Fuluorisenti alawọ ewe (GFP) tabi purine nucleoside phosphorylase (PNP) ṣe awọn hydrogels pẹlu awọn ajẹkù idapọ ti iṣẹ ṣiṣe ni kikun.Ikosile giga-giga ni awọn ọmọ ogun heterologous, pẹlu idasile iyara ti awọn hydrogels labẹ awọn ipo iṣe-ara, ṣii iṣeeṣe ti iṣelọpọ idiyele-doko ti awọn hydrogels pẹlu awọn iṣẹ iṣelọpọ.
Ko dabi ọpọlọpọ awọn ọlọjẹ spidroin recombinant36 ti a royin, His-NT2RepCT jẹ iduroṣinṣin ni ifipamọ Tris-HCl ni pH 8 ati pe o le ni idojukọ si 500 mg/mL laisi ojoriro25.Nitorina, a yà wa lati rii pe amuaradagba yii yarayara awọn fọọmu ti o han kedere, awọn hydrogels ti o ni atilẹyin ti ara ẹni nigbati o ba wa ni 37 ° C (Fig. 1b-d).Awọn ijinlẹ siwaju sii fihan pe Gelation His-NT2RepCT waye lori ọpọlọpọ awọn ifọkansi amuaradagba (10-300 mg / mL) ati pe ifọkansi yii ni ibamu pẹlu akoko gelation (Fig. 1c ati Apọju 1).Lati wa iru awọn apakan ti His-NT2RepCT mediate hydrogel formation, lẹhinna a ṣe ayẹwo agbegbe kọọkan ni ẹyọkan ati ni ọpọlọpọ awọn akojọpọ nipa lilo idanwo inversion flask (Figure 1a,b).Gbogbo awọn ida idanwo ti spidroin recombinant ti o ṣẹda awọn gels (ni ifọkansi amuaradagba ti 300 mg/mL) ni o kere ju 1 h, ayafi fun 2Rep ti o ti ṣaju (Fig. 1b).Eyi ni imọran pe NT ati CT nikan, ni apapo, tabi ni nkan ṣe pẹlu awọn atunṣe, le jeli ni 37 ° C ati pe aami His6 ko ni ipa lori ilana yii si eyikeyi pataki.Fi fun imọran ti o wọpọ pe NT jẹ amuaradagba ti o yanju pupọ ati iduroṣinṣin, ati pe awọn ijabọ iṣaaju ti spidroin hydrogels recombinant ti da awọn ipa gelation si awọn ayipada ibamu ni awọn agbegbe atunwi ati / tabi CT, NT funrararẹ le.Awari ti gelation jẹ airotẹlẹ.Àfikún Tabili 1) 37, 38, 39. Ni ifiyesi, NT tẹlẹ gelled laarin awọn iṣẹju 10 ni ifọkansi ti ≥ 300 mg/mL (Fig. 1c).Awọn adanwo inversion Vial pẹlu ọpọlọpọ awọn ifọkansi ti NT fihan pe ni> 50 mg / mL ojutu NT gelled yiyara ju His-NT2RepCT ni ifọkansi ti o baamu (w / v, Figure 1c).
Aṣoju sikematiki ti ọpọlọpọ awọn itumọ spidroin ti a ṣe iwadi ninu iṣẹ yii.b Gel akoko ni 37 °C fun orisirisi recombinant spidroin awọn ọlọjẹ (300 mg/mL) wadi nipa yiyipada vial.Gel CT lẹsẹkẹsẹ laisi isọdi (<300 mg / mL), 2Rep precipitates (300 mg / mL, iwọn 5 mm).c Gel akoko ti His-NT2RepCT ati NT ni itọkasi amuaradagba ifọkansi ni 37°C.d Awọn fọto ti His-NT2RepCT ati NT hydrogels pẹlu alantakun ati lẹta “NT” ti a tẹ nisalẹ, lẹsẹsẹ (mejeeji 200 mg/mL, igi iwọn 5 mm).
Hydrogels ti a ṣẹda nipasẹ ọpọlọpọ awọn ọlọjẹ spidroin recombinant ni awọn awọ oriṣiriṣi oriṣiriṣi, ati akiyesi oju ihoho fihan awọn iwọn oriṣiriṣi ti akoyawo (Fig. 1b).Awọn gels NT jẹ iyasọtọ ti o han gbangba lakoko ti awọn gels miiran di akomo.His-NT2RepCT ati awọn gels NT ti a sọ sinu awọn tubes cylindrical le yọkuro kuro ninu mimu mimu (Fig. 1d).
Lati ṣe idanwo boya awọn aṣọ wiwọ siliki alantakun adayeba labẹ awọn ipo ti a rii ni bayi lati fa gelation ti awọn ọlọjẹ spidroin recombinant, awọn aṣọ ti a gba lati inu ẹṣẹ ampulla nla ti Spider Afara Swedish (Larinioides sclopetarius).Awọn ideri ti wa ni ipamọ ni 20 mM Tris-HCl ifipamọ ni 50 mg/mL (da lori iwuwo gbigbẹ ti a ṣewọn), ṣugbọn ko si gelation ti a ṣe akiyesi lakoko ifunmọ ọjọ 21 ni 37 °C (Afikun Aworan 2a).
Lati ṣe iwọn awọn gels wọnyi, awọn wiwọn rheological le ṣee lo lati ṣe iwadi ilana gelation ati pinnu awọn ohun-ini ẹrọ gbogbogbo.Ni pataki, mimojuto modulus ipamọ (elasticity) ni awọn iwọn otutu ti o ga le pese alaye lori iwọn otutu gelling ati awọn ohun-ini viscoelastic ti ibora naa.Awọn idanwo iwọn otutu (lilo 1 ° C / min ni 25-45 ° C, ti o da lori awọn iwadii iṣaaju nipa lilo awọn solusan ọja iṣura siliki adayeba) 40,41 fihan pe moduli ipamọ ti His-NT2RepCT ati awọn solusan NT pọ si pẹlu iwọn otutu ti o pọ si.ti a pọ (Fig. 2 ati Afikun eeya. 3).Ni pataki, module NT bẹrẹ dagba ni iwọn otutu kekere ti akawe si His-NT2RepCT, ni ibamu pẹlu akoko gel yiyara ti a ṣakiyesi nigbati NT ti wa ni idawọle taara pẹlu His-NT2RepCT ni 37°C (Figure 1).Lẹhin idinku iwọn otutu ti o tẹle, modulu ibi-itọju ko pada si awọn iye kekere ati pe o wa loke modulus isonu (wo Afikun Ọpọtọ 3), ti o nfihan gelation iduroṣinṣin alaileyipada gbona.Lẹhin gelation, modulus rirọ ikẹhin wa lati 15 si 330 kPa fun His-NT2RepCT hydrogels ni ifọkansi ti 100-500 mg/mL, ati modulus rirọ ikẹhin fun NT hydrogels (100-500 mg/mL) wa lati 2 si 1400 kPa (Fig., 2 ati pipe data rampu) wo Aworan Afikun. 3).
Iyipada ni iwọn otutu lakoko awọn wiwọn His-NT2RepCT (300 mg/mL) ati b NT (300 mg/mL) pẹlu gbigbọn.Awọn itọka tọkasi aṣa iwọn otutu, ati iboji fẹẹrẹfẹ ti data module ibi ipamọ n ṣe afihan idanwo ni awọn iye iyipo kekere fun ohun elo ju ti a ti ṣalaye nipasẹ olupese, eyiti o jẹ idi ariwo ti o pọ si.c ikojọpọ module-ipari ti His-NT2RepCT ati NT lẹhin iwọn otutu ti o ga (100, 300, ati 500 mg/mL).Gbogbo awọn kika module ni a gba ni igbohunsafẹfẹ ti 0.1 Hz.
Gẹgẹbi ọna ti o pọju fun ṣiṣewadii awọn iyipada iyipada ti o ni nkan ṣe pẹlu gelation, a ṣe igbasilẹ FTIR spectra ti His-NT2RepCT ati NT ṣaaju ati lẹhin gelation ni 37 ° C (Figure 3a,b).Gẹgẹbi a ti ṣe yẹ, iwoye ti His-NT2RepCT ati awọn solusan NT ni ibamu si awọn ọlọjẹ ti o nfihan α-helix/random coil system secondary, pẹlu ẹgbẹ oyè ni 1645 cm-1.Fun awọn mejeeji hydrogels, gelation yorisi ni awọn Ibiyi ti meji apa ni aarin I band ni nipa 1617 cm-1 ati 1695 cm-1 (Fig. 3a, b), afihan awọn Ibiyi ti antiparallel β-dì ẹya.Awọn ayipada wọnyi tun le rii ni kedere ni itọsẹ keji ti o yatọ ati iyatọ gelation spectra (Eya afikun. 4b).Awọn ẹgbẹ meji ti NT β-Layer jẹ diẹ sii ju awọn ti His-NT2RepCT lọ, ti o nfihan pe lapapọ akoonu ti awọn bands β-Layer ninu NT hydrogel ga ju ti NT2RepCT hydrogel.
irisi gbigba FTIR ti His-NT2RepCT ati b NT (mejeeji 500 mg/mL) ṣaaju (ojutu) ati lẹhin (gel) idabobo ni 37°C.c Awọn aworan TEM ti awọn gels NT2RepCT 50 mg/ml ati d NT.Pẹpẹ iwọn 200 nm.e Fiber diameters ti His-NT2RepCT ati NT hydrogels.n = 100 wiwọn fibrils, p <0.0001.Awọn ifi aṣiṣe fihan iyapa boṣewa.Aarin ti awọn ifi aṣiṣe jẹ itumọ.Idanwo t-meji ti a ko so pọ (tailed) ni a lo fun itupalẹ iṣiro.f ThT fluorescence ti awọn orisirisi awọn ọlọjẹ spidroin recombinant (100 mg/mL) ni 37 °C laisi gbigbọn.g NT (100 mg/mL) awọn adanwo inoculation lati 100 mg/mL NT gel pẹlu 0%, 5%, 10%, ati 20% awọn irugbin.
Onínọmbà ti gel nipa lilo microscopy elekitironi gbigbe (TEM) fihan pe hydrogel ni awọn fibrils amyloid-like (Figs. 3c, 3d).Awọn fibrils NT ti a ṣe ni elongated (5-12 nm ni iwọn ila opin) ati ti ko ni ẹka, lakoko ti awọn fibrils His-NT2RepCT ti kuru ni ipari ati ni pataki ni iwọn ila opin (7-16 nm) (Fig. 3e).Awọn abajade wọnyi gba wa laaye lati tẹle awọn kinetics ti fibrosis nipa lilo idanwo thioflavin T (ThT).Fun gbogbo awọn ọlọjẹ spidroin recombinant, ifihan agbara fluorescent pọ si nigbati awọn ayẹwo ba wa ni 37 °C (Fig. 3f, Apọju Apọju. 5a).Ni ibamu pẹlu wiwa yii, idanwo airi ti NT ati His-NT2RepCT labẹ awọn ipo gelling ṣe afihan ilosoke isokan ni ThT fluorescence lai ṣe akiyesi ikojọpọ agbegbe ti awọn akopọ ThT-rere (Afikun Fig. 5b, c).Ipilẹṣẹ ti ThT-positive fibrils ko ni atẹle pẹlu ilosoke ninu NT ati turbidity Re-NTCT (Afikun Fig. 5d), eyi ti o tumọ si pe nẹtiwọki ti fibrils ninu gel le dagba laisi ibajẹ gel kedere.Igbingbin nipa fifi awọn iwọn kekere ti awọn fibril ti a ti kọ tẹlẹ le ṣe alekun iṣelọpọ fibril ni pataki ti diẹ ninu awọn amyloids42,43,44 ṣugbọn fifi 5%, 10% tabi 20% (w/w) NT kun si ojutu ti NT hydrocoagulants.ipa irugbin (olusin 3g).Boya eyi jẹ nitori otitọ pe awọn fibrils ti o wa ninu hydrogel jẹ ti o wa titi ati pe a ko le lo bi awọn irugbin.
Ihuwasi airotẹlẹ ti awọn ọlọjẹ spidroin recombinant ni awọn iwọn otutu ti o ga fa siwaju awọn iwadi iwoye ti o ni agbara iparun (NMR) lati ṣe idanimọ awọn iyipada isọdi ti o ni nkan ṣe pẹlu iṣelọpọ gel.NMR sipekitira ti His-NT2RepCT awọn solusan ti o gbasilẹ ni akoko ni 37 ° C fihan pe CT tun ti ṣe pọ ni apakan, lakoko ti awọn ifihan agbara NT ati 2Rep ti sọnu (Fig. 4a), ni iyanju pe o jẹ akọkọ NT ati 2Rep ti o ni iṣakoso apakan apakan ti iṣelọpọ His- NT2RepCT hydrogel.Ifihan CT naa tun dinku si 20% ti kikankikan atilẹba rẹ, ni iyanju pe CT tun wa ni ipilẹ pupọ julọ ati dapọ si eto hydrogel.Fun ipin ti o kere ju ti CT, eyiti o jẹ alagbeka bi ninu apẹẹrẹ ti a ti sọ tẹlẹ ati nitorinaa ṣe akiyesi nipasẹ ojutu NMR, spectra ko ni awọn ifihan agbara fun awọn iṣẹku eleto 10 akọkọ, o ṣee ṣe nitori aibikita ti o nira ti apakan ti a so ti His-NT2Rep.Awọn iwoye NMR ti -state of hydrogels -NT2RepCT ṣe afihan wiwa ti o ga julọ ti α-helices ati β-layers ati, si iwọn ti o kere ju, conformation coil ID (Fig. 4b).Iṣiro iyipada kemikali ti awọn iṣẹku methionine ti o wa ni NT nikan fihan pe agbegbe yii ti ni iyipada si igbekalẹ β-sheet kan.Awọn iwoye ti o gbẹkẹle akoko ti NT ni ojutu fihan idinku aṣọ kan ni kikankikan ifihan agbara (Fig. 4c), ati NMR-ipinle ti o lagbara ti NT hydrogels fihan pe pupọ julọ awọn iṣẹku NT ti yipada si awọn ẹya β-sheet (Fig. 4d).Ibamu ti 2Rep ko le ṣe ipinnu lọtọ nitori ifarahan rẹ lati ṣajọpọ.Bibẹẹkọ, iwoye NMR ipinlẹ ti o lagbara ti NTCT ati His-NT2RepCT hydrogels dabi iru pupọ (Fig. 4b; Aworan Iyọrisi. 6b), ni iyanju pe 2Rep ṣe alabapin diẹ si apakan igbekalẹ ti His-NT2RepCT hydrogel.Fun CT hydrogels, α-helices, β-sheets, ati awọn ẹya ile-iwe keji ti helical laileto ni a rii lati wa tẹlẹ (Afikun 6d).Eyi ni imọran pe diẹ ninu awọn ẹya ti CT wa α-helices nigba ti awọn miiran di β-sheets.Nitorinaa, awọn abajade ti NMR spectroscopy daba pe NT ṣe pataki fun iṣelọpọ hydrogel ati pe o tun yipada si ibaramu β-sheet lori idapọ pẹlu 2Rep ati CT.Ni ibamu pẹlu eyi, laipẹ a rii pe awọn zippers spatial amyloid le ṣe ni gbogbo awọn helices marun ti agbegbe NT, ati Waltz algorithm sọ asọtẹlẹ agbegbe amyloidogenic ni helix 1 (Fig. 4e).
2D spectra ti 15N-HSQC 10 mg/mL His-NT2RepCT ojutu ṣaaju (bulu) ati 19 wakati lẹhin abeabo (pupa) ni 37°C.Olukuluku awọn oke agbelebu ni spekitiriumu pupa ati F24, G136, polyA ni spectrum buluu jẹ itọkasi nipasẹ awọn aami amino acid lẹta kan ati awọn nọmba iyokù.Awọn insets ṣe afihan igbẹkẹle ti kikankikan ifihan agbara ni akoko fun awọn iṣẹku ti o yan lati awọn ibugbe NT, 2Rep, ati CT.b ri to-ipinle radiofrequency (RFDR) sipekitira ti Re-NT2RepCT hydrogels.Awọn ibamu ti awọn iṣẹku Cα/Cβ ti a ṣe akiyesi ni iwoye RFDR ni a pinnu nipasẹ lafiwe pẹlu awọn iyipada kemikali peptide awoṣe ati awọn iye ti o wa lati awọn iṣiro82,83 ati awọn ẹya ile keji wọn.SSB – yiyi sideband.c spectra onisẹpo kan ti 15N-HSQC 10 mg/mL ojutu NT lakoko isọdọmọ ni 37 °C fun awọn wakati 36.Inset fihan kikankikan volumetric dipo akoko.d ri to ipinle RFDR sipekitira ti NT hydrogels.Awọn ibamu ti awọn iṣẹku Cα/Cβ ati awọn ẹya ile-keji wọn ti a ṣe akiyesi ni iwoye RFDR jẹ itọkasi.e Da lori profaili propensity fibrillation NT45.79 lati ibi ipamọ data Zipper (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/).Agbara Rosetta ti window iṣipopada monomono aaye ti hexapeptide han ni kcal/mol.Awọn ifi pupa tọkasi awọn hexapeptides pẹlu itọsi fibrosis giga (agbara Rosetta ni isalẹ -23 kcal/mol; ni ​​isalẹ ila ti o ni aami).Awọn ifi alawọ ewe tọkasi awọn ajẹkù pẹlu awọn agbara Rosetta loke iloro ati nitorinaa o ṣeese lati ṣe awọn apo idalẹnu sitẹriki.Awọn ajẹkù ti o ni proline ni a yọkuro lati inu itupalẹ (laisi awọn ọwọn).Awọn onigun tọka si awọn agbegbe ti amyloidosis ti asọtẹlẹ nipasẹ Waltz algorithm81 (https://waltz.switchlab.org).Ọkọọkan ti awọn iṣẹku amino acid ti NT wa ni oke, ati awọn iru awọn iṣẹku ti a rii ninu eto ile-ẹkọ keji β (ti pinnu nipasẹ spectroscopy NMR-ipinle to lagbara) jẹ afihan ni pupa.Awọn ipo ti awọn NT α-helices marun jẹ apẹrẹ bi (H1-H5)28.
Ni pH <6.5, HT dimerizes, ni sooro si ooru- tabi urea-induced denaturation18.Lati ṣe alaye bi NT dimerization ati iduroṣinṣin ṣe ni ipa lori gelation, awọn solusan ti o ni 100 mg/ml NT ni a ṣakoso ni pH 8, 7, ati 6 ni lilo idanwo inversion vial.Awọn ayẹwo NT ti o wa ni pH 8 ati 7 gelled lẹhin 30 min ni 37 ° C, ṣugbọn pH 8 gel wa ni kedere, lakoko ti pH 7 gel ṣe afihan itọsi ti o han (Fig. 5a).Ni idakeji, ojutu kan ti o ni HT ni pH 6 ko ṣe jeli kan, ati pe o le rii ojo nla kan lẹhin iṣẹju 20 ni 37 ° C.Eyi ni imọran pe dimers ara wọn ati / tabi iduroṣinṣin ti o ga julọ ti a fiwe si awọn monomers ṣe idiwọ gelation.Ipilẹṣẹ ti ojoro fun NT ni pH 7 ati 6 ko nireti, nitori o ti royin pe NT jẹ tiotuka ni 200 mg / ml27, ni irọrun tun ṣe lẹhin denaturation ooru, ati tun ṣe idaduro α-helix ni awọn iye kekere ti pH 18. Alaye ti o ṣeeṣe fun awọn aiṣedeede wọnyi ni pe awọn adanwo ti a royin tẹlẹ ni a ṣe ni iwọn otutu yara tabi ni isalẹ, tabi ni awọn ifọkansi amuaradagba kekere16,18,19.
Idanwo inversion vial NT (100 mg/mL) ni pH 8, 7, 6 ati 154 mM NaCl (pH 8) lẹhin idabo ni 37°C.b NT CD sipekitira pẹlu ati laisi 154 mM NaF ati 154 mM NaCl, lẹsẹsẹ.Molar ellipticity ni 222 nm ti wa ni iyipada si ipin ti awọn agbo adayeba.c NT inversion assay (100 mg/mL) NT * (37 °C ati 60 °C), NTA72R (37 °C), ati His-NT-L6 (37 °C ati 60 °C).d CD spectra ti NT mutanti NT *, NTA72R, ati Re-NT-L6.Molar ellipticity ni 222 nm ti wa ni iyipada si ipin ti awọn agbo adayeba.e Idanwo Iyipada ti NTFLSp, NTMiSp ati dinku NTMiSp (100 mg/mL).Opa iwọn 5 mm.f CD sipekitira ti NT, NTFLSp, NTMiSp ati din NTMiSp.Molar ellipticity ni 222 nm ti wa ni iyipada si ipin ti awọn agbo adayeba.Sipekitira NT ni kikun ni 25 °C ati 95 °C ni a fihan ni Afihan Afikun 8.
Idojukọ iyọ ti ara ṣe ipinnu awọn ibaraenisepo electrostatic laarin awọn ipin NT ati dimerization ti gbigbe NT si pH18 kekere.A rii pe wiwa ti 154 mM NaCl ati NaF ṣe nitootọ ni idinamọ gelation, lẹsẹsẹ (Fig. 5a, b; Apọju 2b) ati pe awọn iyọ wọnyi pọ si iduroṣinṣin igbona ti awọn monomers NT (Fig. 5b, Fig. 8). .O tun ni imọran pe imudara iduroṣinṣin, kuku ju dimerization, ṣe idiwọ iṣelọpọ gel.
Lati ṣe iwadii siwaju si ipa ti dimerization amuaradagba ati iduroṣinṣin ni gelation, a lo awọn ẹda meji, NT * ati NTA72R, eyiti o tun jẹ monomeric ni kekere pH28.30.NT * jẹ iyipada iyipada idiyele ilọpo meji ninu eyiti pinpin idiyele dipolar ti o han gbangba ti monomer jẹ fifẹ, eyiti o ṣe idiwọ dimerization ati mu iduroṣinṣin monomer pọ si.NTA72R jẹ dipole ti o gba agbara, ṣugbọn Arg-rọpo Ala wa ni agbegbe dimer, nitorinaa awọn iyipada dabaru pẹlu awọn ibaraenisepo subunit ti o nilo fun dimerization.Lori ifisi ni 37 ° C, NT * ko ṣe hydrogel kan, lakoko ti NTA72R ṣe apẹrẹ gel opaque fun 15 min (Fig. 5c).Niwon mejeeji NT * ati NTA72R ko le dimerize sugbon yato ni monomer iduroṣinṣin (Fig. 5d), wọnyi esi strongly daba wipe ga thermodynamic iduroṣinṣin idilọwọ NT lati gelling.Eyi tun ni atilẹyin nipasẹ otitọ pe HT * fọọmu gel kan nigbati o jẹ riru ni iwọn otutu giga (lẹhin 8 min ni 60 ° C; Fig. 5c).O ti fihan ni iṣaaju pe akoonu giga ti methionine ni NT jẹ ki kika kika adayeba rẹ ati pe mẹfa Met si awọn aropo Leu (ti a tọka si nibi bi Rẹ-NT-L6) ṣe iduroṣinṣin monomer NT46 ni agbara.Da lori ero pe a nilo irọrun igbekalẹ fun dida NT gel, a rii pe ẹda iduroṣinṣin His-NT-L6 ko ṣe gel ni 37 °C (Figure 5c, d).Sibẹsibẹ, His-NT-L6 tun ṣẹda gel kan lori idabobo ni 60 ° C fun awọn iṣẹju 60 (Fig. 5c).
Agbara NT lati yipada si awọn ẹya β-sheet ati fọọmu hydrogels han lati kan si diẹ ninu ṣugbọn kii ṣe gbogbo awọn ibugbe NT ti spidroin.Awọn NT lati oriṣiriṣi awọn iru siliki ati awọn eya Spider, Trichonephila clavipes (NTFlSp), awọn gels ti a ṣẹda laibikita akoonu methionine kekere ti wọn kere ati iduroṣinṣin igbona giga (Fig. 5e, f ati Table Afifun 2).Ni idakeji, NT lati kekere amuaradagba ampullar spidroin lati Araneus ventricosus (NTMiSp) pẹlu imuduro gbigbona kekere ati akoonu methionine ti o ga julọ ko ṣe awọn hydrogels (Ififun Tabili 2 ati Fig. 5e, f).Awọn igbehin le ni nkan ṣe pẹlu wiwa intramolecular disulfide bonds29,47.Ni igbagbogbo, nigbati awọn ifunmọ disulfide ti NTMiSp ti dinku, o ṣẹda hydrogel kan lẹhin idabobo ni 37 ° C fun awọn iṣẹju 10 (Fig. 5e).Ni ipari, o yẹ ki o ṣe akiyesi pe irọrun igbekale jẹ pataki, ṣugbọn kii ṣe nikan, ami iyasọtọ fun dida gel kan lati NT.Ohun miiran ti o le ṣe pataki ni itara lati ṣe awọn fibrils amyloid, ati itupalẹ pẹlu ibi ipamọ data idalẹnu ati Waltz algorithm ṣe afihan ibamu laarin agbara lati ṣe awọn gels ati niwaju awọn agbegbe amyloidogenic, bakanna bi iwọn awọn agbegbe ti sọtẹlẹ. lati dagba sitẹriki zippers.Ibaṣepọ kan wa (Tabili Iyọkuro 2 ati Aworan Apọju. 9).
Agbara NT lati ṣe awọn fibrils ati awọn fọọmu gels labẹ awọn ipo ti o dara mu wa lati ṣe akiyesi pe awọn idapọ NT pẹlu awọn ajẹku amuaradagba miiran le tun ṣe awọn gels pẹlu iṣẹ kikun ti awọn alabaṣepọ idapọ.Lati ṣe idanwo eyi, a ṣe agbekalẹ amuaradagba Fuluorisenti alawọ ewe (GFP) ati purine nucleoside phosphorylase (PNP) ni C-terminus ti NT, lẹsẹsẹ.Abajade awọn ọlọjẹ fusion ti a fihan ni E. coli pẹlu awọn ikore ikẹhin ti o ga pupọ (150 mg / L ati 256 mg/L awọn aṣa flask gbigbọn fun His-NT-GFP ati His-NT-PNP, lẹsẹsẹ), ni ibamu pẹlu ohun ti a fihan fun Awọn ọlọjẹ miiran ti a dapọ si NT Ref.30. His-NT-GFP (300mg / mL) ati His-NT-PNP (100mg / mL) awọn ọlọjẹ idapọ ti o ṣẹda awọn gels lẹhin awọn wakati 2 ati awọn wakati 6.5 ni 37 ° C ati, pataki, apakan GFP ko yipada.šakiyesi lẹhin gelation, pẹlu> 70% ti ibẹrẹ fluorescence kikankikan ti o ku lẹhin gelation (Fig. 6a).Lati wiwọn iṣẹ-ṣiṣe PNP ninu awọn solusan-NT-PNP rẹ ati awọn gels, a ni lati dilute amuaradagba idapọ pẹlu NT nitori iṣẹ enzymatic ti igbaradi mimọ wa ni ita ibiti o rii ti idanwo ni awọn ifọkansi gelling.Geli ti a ṣe pẹlu adalu ti o ni 0.01 mg / mL His-NT-PNP ati 100 mg / mL NT ni idaduro 65% ti iṣẹ enzymatic akọkọ ti awọn ayẹwo ti a ti ṣaju (Fig. 6b).Geli naa wa ni idaduro lakoko wiwọn (Eya afikun. 10).
Kikankikan fluorescence ibatan ṣaaju ati lẹhin gelation ti His-NT-GFP (300 mg/mL) ati vial inverted ti o ni His-NT-GFP hydrogel (300 mg/mL) labẹ han ati ina UV.Awọn aaye fihan awọn wiwọn ẹni kọọkan (n = 3), awọn ifi aṣiṣe fihan iyapa boṣewa.Awọn apapọ iye ti han ni aarin ti awọn ifi aṣiṣe.b PNP aṣayan iṣẹ-ṣiṣe ni a gba nipasẹ iṣiro fluorometric nipa lilo awọn iṣeduro ati awọn gels ti o ni NT (100 mg / ml) ati adalu ti o ni 0.01 mg / ml his-NT-PNP ati 100 mg / ml New Taiwan dollars.Awọn inset fihan vial inverted ti o ni awọn kan hydrogel ti o ni awọn His-NT-PNP (5 mm asekale bar).
Nibi, a ṣe ijabọ dida awọn hydrogels lati NT ati awọn ọlọjẹ spidroin recombinant miiran nipa sisọ ojutu amuaradagba ni 37 ° C (Figure 1).A fihan pe gelation ni nkan ṣe pẹlu iyipada ti α-helices sinu β-layers ati iṣeto ti amyloid-like fibrils (Figs. 3 ati 4).Wiwa yii jẹ iyalẹnu bi awọn NTs ti wa ni awọn edidi globular marun-helix ti a mọ fun solubility giga giga wọn ati iduroṣinṣin giga ni awọn ifọkansi> 200 mg/mL ni 4 ° C fun ọpọlọpọ awọn ọjọ27.Ni afikun, awọn NTs ni imurasilẹ ṣe atunṣe lẹhin denaturation ooru ni awọn ifọkansi amuaradagba kekere ni µM.Gẹgẹbi awọn abajade wa, iṣelọpọ fibril nilo apapo> 10 mg / mL ifọkansi amuaradagba ati iwọn otutu ti o ga (Fig. 1).Eyi ni ibamu pẹlu imọran pe awọn fibrils amyloid le dagba lati awọn ọlọjẹ ti a ṣe pọ globularly ti o wa ni ipo ti a ti sọ silẹ nitori awọn iyipada ti o gbona labẹ awọn ipo iṣe-ara 48.Awọn apẹẹrẹ ti awọn ọlọjẹ ti o faragba iyipada yii pẹlu insulin49,50, β2-microglobulin, transthyretin ati lysozyme51,52,53.Botilẹjẹpe NT jẹ α-helix ni ilu abinibi rẹ, to 65% ti pq polypeptide jẹ ibamu pẹlu idasile idalẹnu sitẹri (Fig. 4e) 45.Niwọn igba ti monomer jẹ alagbeka ni agbara46, o le ṣe afihan awọn agbegbe amyloidogenic ti o pọju wọnyi ni awọn iwọn otutu ti o ga niwọntunwọnsi ati ni awọn ifọkansi giga ti amuaradagba lapapọ le de ibi ifọkansi pataki fun iṣelọpọ amyloid fibril54.Ni atẹle ero yii, a rii ibamu odi laarin ifọkansi spidroin ati akoko gelation (Fig. 1c), ati pe ti monomeric NT conformation jẹ iduroṣinṣin boya nipasẹ awọn iyipada (NT *, His-NT-L6) tabi nipasẹ afikun iyọ, le ṣe idiwọ naa hydrogels idasile (olusin 5).
Ni ọpọlọpọ igba, amyloid fibrils farasin lati ojutu bi a precipitate, ṣugbọn labẹ awọn ipo ti won le dagba hydrogels55,56,57.Awọn fibrils ti n ṣe agbekalẹ Hydrogel ni igbagbogbo ni ipin abala ti o ga ati ṣe agbekalẹ awọn nẹtiwọọki onisẹpo mẹta iduroṣinṣin nipasẹ isunmọ molikula, 55,58 ni ibamu pẹlu awọn abajade wa.Fun idasile hydrogel ni vitro, awọn ọlọjẹ nigbagbogbo ni kikun tabi ni apakan ṣiṣi silẹ, fun apẹẹrẹ, nipasẹ ifihan si awọn nkan ti o nfo Organic, iwọn otutu giga (70-90 ° C) ati / tabi pH kekere (1.5-3.0) 59,60,61,62.Awọn hydrogels spidroin ti a ṣapejuwe nibi ko nilo sisẹ lile, tabi wọn ko nilo awọn aṣoju ọna asopọ agbelebu lati mu awọn hydrogels duro.
O ti royin tẹlẹ pe spidroin tun ṣe ati awọn QDs, eyiti o dabi pe o ni iyipada β-sheet lakoko yiyi siliki, ṣe awọn hydrogels.Ti a ṣe afiwe si awọn awari wa, awọn akoko idabo ati / tabi awọn iwọn otutu itusilẹ jẹ pataki gun tabi ga julọ, ni atele, ati awọn hydrogels ti o jẹ abajade nigbagbogbo jẹ opaque (Figure 7 ati Tabili Iyọkuro 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. Ni afikun si awọn akoko gel ti o yara, NT hydrogels> 300 mg / mL (30%) ju gbogbo awọn hydrogels protein siliki spider siliki ti a ṣe apejuwe, ati awọn hydrogels adayeba gẹgẹbi gelatin, alginate (2%), agar (0.5%). ) ati collagen.(0.6%) (Eyaworan 7 ati Awọn tabili afikun 1 ati 3) 37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
Akoko jeli ati modulu rirọ ti awọn hydrogels ninu iwadi yii ni a ṣe afiwe pẹlu awọn hydrogels orisun spidroin miiran ati awọn hydrogels adayeba ti a yan.Awọn itọkasi ni a fun pẹlu apejuwe awọn ipo gelation.APS Ammonium persulfate, iwọn otutu yara.Data 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
Awọn Spiders han lati ti ni idagbasoke awọn ọna lati ṣe idiwọ spidroin lati gelling nigba ipamọ.Pelu ifọkansi giga ti amuaradagba ninu ẹṣẹ siliki, agbegbe atunwi nla ti o ni nkan ṣe pẹlu agbegbe ebute tumọ si pe ifọkansi ti o han NT ati CT ninu ẹṣẹ naa ni ibamu si isunmọ 10-20 mg/ml, ni aala ti iwadii yii.nilo fun dida hydrogel ti a ṣe akiyesi ni fitiro.Ni afikun, iru awọn ifọkansi ti iyọ 16 diduro NT, bi ni siliki keekeke ti (Fig. 5b).A ti ṣe iwadi NT conformation ni E. coli cytosol ati pe o wa ni wiwọ diẹ sii ju igba ti a ṣe ayẹwo ni vitro, ti o nfihan siwaju sii pe iyo tabi awọn nkan miiran ṣe idilọwọ iṣakopọ rẹ ni vivo.Sibẹsibẹ, agbara ti awọn NT lati yipada si awọn fibril β-sheet le jẹ pataki fun iṣelọpọ filament ati pe o yẹ ki o ṣe iwadii ni awọn ẹkọ iwaju.
Ni afikun si awọn ẹya aramada ti NT-amyloid-like fibril ati iṣelọpọ hydrogel ti a ṣe akiyesi ninu iwadi yii, a tun fihan pe iṣẹlẹ yii le ni awọn ohun elo imọ-ẹrọ ati imọ-ẹrọ (Fig. 8).Gẹgẹbi ẹri ti imọran, a ṣe idapo NT pẹlu GFP tabi PNP ati fihan pe amuaradagba idapọ tun ṣe awọn hydrogels nigbati o ba wa ni 37 °C ati pe awọn ida GFP ati PNP ṣe idaduro iṣẹ wọn lẹhin gelation (Nọmba 6).Nucleoside phosphorylases jẹ idawọle pataki ti nucleoside analogues75, eyiti o jẹ ki iṣawari wa ni ibamu fun ile-iṣẹ biopharmaceutical.Ero ti sisọ awọn ọlọjẹ idapọ ti o dagba awọn hydrogels sihin labẹ awọn ipo ọjo ngbanilaaye ẹda ti awọn hydrogels ti o ṣiṣẹ pẹlu awọn ohun-ini ọjo fun ọpọlọpọ awọn ohun elo bii aibikita henensiamu, itusilẹ oogun iṣakoso ati imọ-ẹrọ àsopọ.Ni afikun, NT ati NT * jẹ awọn ami ikosile daradara30, eyiti o tumọ si pe NT ati awọn iyatọ rẹ le ṣee lo fun iṣelọpọ iṣelọpọ giga ti awọn ọlọjẹ idapọmọra ati ẹda ti o tẹle ti awọn ọlọjẹ ibi-afẹde aibikita ni awọn hydrogels 3D.
NT jẹ tiotuka, α-helical ati iduroṣinṣin ni awọn ifọkansi kekere (µM) ati 37°C.Ni iwọn otutu kanna, ṣugbọn ni awọn ifọkansi ti o pọ si (> 10 mg / ml), NT ṣe awọn gels ti o ni awọn fibrils amyloid-like.Awọn ọlọjẹ idapọ NT tun ṣe awọn gels fibrillar pẹlu awọn ajẹkù idapọ ti iṣẹ ni kikun, gbigba awọn ọlọjẹ lọpọlọpọ lati wa ni aibikita ni awọn hydrogels 3D ni lilo NT.Isalẹ: NT (PDB: 4FBS) ati awọn apejuwe ti awọn nẹtiwọọki okun ati awọn ẹya amuaradagba ti o somọ (ti a ro pe ko fa si iwọn, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2210/pdb4).
Awọn itumọ (wo Afikun Tabili 4 fun atokọ pipe pẹlu awọn ilana amino acid) ni a ṣe cloned sinu plasmid pT7 ati yipada si E. coli BL21 (DE3).E. coli ti o ni awọn plasmids ti a ṣe atunṣe ni a ṣe itọsi ni Luria broth ti o ni afikun pẹlu kanamycin (70 mg / l) ati dagba ni alẹ ni 30 ° C ati 250 rpm.Lẹhinna aṣa naa jẹ itọsi 1/100 sinu alabọde LB ti o ni kanamycin ninu ati gbin ni 30°C ati 110 rpm titi OD600 fi de 0.8.Fun awọn ẹkọ NMR, awọn kokoro arun ti dagba ni M9 kekere alabọde ti o ni 2 g ti D-glucose 13C (Aldrich) ati 1 g ti ammonium kiloraidi 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) fun aami amuaradagba pẹlu isotopes.Sokale iwọn otutu si iwọn 20 Celsius ati fa ikosile amuaradagba pẹlu 0.15 mM isopropylthiogalactopyranoside (ifojusi ikẹhin).Lẹhin ikosile amuaradagba alẹ, awọn sẹẹli ni ikore ni 7278 × g, 4 ° C fun awọn iṣẹju 20.Awọn pelleti sẹẹli ni a tun daduro ni 20 mM Tris-HCl, pH 8, ati tio tutunini titi di lilo siwaju.Awọn sẹẹli Thawed ni a lysed ni lilo idalọwọduro sẹẹli (awọn ẹrọ jara TS, Constant Systems Limited, England) ni 30 kPa.Lẹhinna awọn lysates ti wa ni centrifuged ni 25,000 g fun awọn iṣẹju 30 ni 4 ° C.Fun NTMiSp, pellet naa ti tun daduro ni 2 M urea, 20 mM Tris-HCl, pH 8, ati sonicated fun awọn iṣẹju 2 (2 s tan/pa, 65%), lẹhinna centrifuged lẹẹkansi ni 25,000 xg, 4° C. laarin 30 min.Awọn supernatant ti a ti kojọpọ lori kan Ni-NTA iwe, fo pẹlu 20 mM Tris-HCl, 2 mM imidazole, pH 8, ati nipari awọn amuaradagba ti a eluted pẹlu 20 mM Tris-HCl, 200 mM imidazole, pH 8. Lati se ina NT2RepCT ati NTCT, tito nkan lẹsẹsẹ thrombin ṣafihan aaye naa (ThrCleav) laarin Rẹ ati NT.Awọn aaye cleavage Thrombin tun wa ninu His-NT-ThrCleav-2Rep (ṣe 2Rep), His-thioredoxin-ThrCleav-NT (ṣe NT), His-thioredoxin-ThrCleav-CT (ṣe CT), His-Thioredoxin-ThrCleav-NT .* (ṣe NT *), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (ṣe NTA72R), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (ṣe NTF1Sp), ati His-sulfur Redoxin-ThrCleav-NTMiSp (nse NTMiSp).Awọn itumọ ti wa ni digested pẹlu thrombin (1: 1000) ati dialyzed moju ni 4 ° C. pẹlu 20 mM Tris-HCl, pH 8, lilo a Spectra/Por dialysis awo pẹlu kan molikula àdánù ala ti 6-8 kDa.Lẹhin iṣọn-ara, ojutu ti wa ni ti kojọpọ sori iwe Ni-NTA ati pe itunjade ti o ni amuaradagba ti iwulo ni a gba.Awọn ifọkansi amuaradagba ni ipinnu nipasẹ wiwọn gbigba UV ni 280 nm ni lilo olusọdipúpọ iparun ti amuaradagba kọọkan, ayafi fun NTF1Sp, eyiti o lo idanwo Bradford ni ibamu si ilana ti olupese.Mimọ jẹ ipinnu nipasẹ SDS polyacrylamide (4–20%) gel electrophoresis ati Coomassie didan buluu.Awọn ọlọjẹ ni ogidi nipa lilo awọn asẹ centrifuge (VivaSpin 20, GE Healthcare) ni 4000 xg pẹlu gige iwuwo molikula 10 kDa ni awọn akoko iṣẹju 20.
Di ojutu amuaradagba naa ki o farabalẹ pipet 150 µl sinu vial septum ko o milimita 1 (8 x 40 mm Thermo Scientific).Awọn tubes ti wa ni pipade ati ki o fi edidi pẹlu parafilm lati ṣe idiwọ evaporation.Awọn ayẹwo (n = 3) ti wa ni idawọle ni 37°C tabi 60°C ati yiyi pada lorekore lati ṣe akiyesi gelation.Awọn ayẹwo ti ko ṣe gel ti wa ni abẹla fun o kere ju ọsẹ kan.Dinku NTMiSp disulfide iwe adehun pẹlu 10 mM DTT fun 10 µM amuaradagba.Lati ṣe itupalẹ gelation ti awọn ohun elo siliki alantan adayeba, a ti ge Spider Afara Swedish, awọn keekeke ti ampulated akọkọ meji ni a gbe sinu 200 μl ti 20 mM Tris-HCl buffer pH 8 ati ge lati jẹ ki a bo lati ya kuro ninu awọn keekeke..Awọn akoonu ti awọn keekeke ti wa ni tituka ni ifipamọ, 50 µl fun ipinnu iwuwo gbigbẹ (nipasẹ abeabo ti awọn lẹgbẹrun ṣiṣi ni 60 °C si iwuwo igbagbogbo) ati 150 µl fun gelation ni 37 °C.
Geometri wiwọn / irinṣẹ jẹ ti irin alagbara, irin ni lilo awo ti o jọra pẹlu iwọn ila opin ti 20 mm ati aafo ti 0.5 mm.Ooru awọn ayẹwo lati 25 °C to 45 °C ati ki o pada si 25 °C ni kan oṣuwọn ti 1 °C fun iseju lilo a alagbara, irin isalẹ Peltier awo.Awọn wiwọn gbigbọn ni a ṣe ni igbohunsafẹfẹ ti 0.1 Hz ati ni agbegbe viscoelastic laini ti ohun elo ni igara ti 5% ati 0.5% fun awọn ayẹwo ti 100 mg/mL ati 300-500 mg/mL, lẹsẹsẹ.Lo iyẹwu ọriniinitutu aṣa lati ṣe idiwọ evaporation.A ṣe atupale data nipa lilo Prism 9.
Fun gbigba awọn iwo infurarẹẹdi (IR) ni iwọn otutu yara lati 800 si 3900 cm-1.Ẹrọ ATR naa, bakanna bi ọna ina nipasẹ spectrometer, ti wa ni mimọ pẹlu afẹfẹ ti o gbẹ ṣaaju ati lakoko idanwo naa.Awọn ojutu (500 miligiramu / milimita lati dinku awọn oke gbigba omi ni iwoye) ni a fi paipu sori awọn kirisita, ati awọn gels (500 mg/mL) ni a ṣẹda ṣaaju wiwọn ati lẹhinna gbe lọ si awọn kirisita (n = 3).Awọn iwoye 1000 ni a gba silẹ pẹlu ipinnu ti 2 cm-1 ati iṣẹ-ṣiṣe odo odo ti 2. A ṣe iṣiro itọsẹ keji nipa lilo OPUS (Bruker) nipa lilo iwọn didan ti awọn aaye mẹsan.Awọn iwoye naa jẹ deede si agbegbe isọpọ kanna laarin 1720 ati 1580 cm-1 nipa lilo F. Menges "Spectragryph - Software Spectroscopy Optical".Ni ATR-IR spectroscopy, ijinle ilaluja ti ina infurarẹẹdi sinu ayẹwo jẹ igbẹkẹle igbi, ti o fa gbigba agbara ni awọn nọmba igbi kekere ju ni awọn nọmba igbi ti o ga julọ.Awọn ipa wọnyi ko ti ni atunṣe fun iwoye ti o han ni Ọpọtọ.3 nitori pe wọn kere pupọ (Afikun 4).Awọn iwoye ti a ṣe atunṣe fun eeya yii ni a ṣe iṣiro nipa lilo sọfitiwia Bruker OPUS.
Ni ipilẹ, iwọn pipe ti awọn imudara amuaradagba ṣee ṣe lẹhin deconvolution igbẹkẹle ti awọn paati laarin amide I tente oke.Sibẹsibẹ, diẹ ninu awọn idiwọ dide ni iṣe.Ariwo ninu awọn julọ.Oniranran le han bi (eke) tente oke nigba deconvolution.Ni afikun, oke ti o ga julọ nitori fifun omi ni ibamu pẹlu ipo ti amide I peak ati pe o le ni iru titobi fun awọn ayẹwo ti o ni iye nla ti omi, gẹgẹbi gel olomi ti a ṣe iwadi nibi.Nitorina, a ko gbiyanju lati patapata decompose awọn amide I tente, ati awọn akiyesi wa yẹ ki o nikan wa ni kà ni atilẹyin awọn ọna miiran bi NMR spectroscopy.
Awọn ojutu ti 50 mg/ml NT ati His-NT2RepCT ni a gelled moju ni 37°C.Lẹhinna a ti fomi hydrogel pẹlu 20 mM Tris-HCl (pH 8) si ifọkansi ti 12.5 mg / ml, gbigbọn daradara ati pipetted lati fọ jeli naa.Nigbamii ti, hydrogel ti fomi ni awọn akoko 10 pẹlu 20 mM Tris-HCl (pH 8), 5 μl ti ayẹwo ni a lo si akoj idẹ kan ti a bo pẹlu fọọmu, ati pe a ti yọ ayẹwo ti o pọ ju pẹlu iwe fifọ.Awọn ayẹwo ni a fo lẹẹmeji pẹlu 5 µl ti omi MilliQ ati pe o ni abawọn pẹlu 1% uranyl formate fun awọn iṣẹju 5.Yọ idoti pupọ kuro pẹlu iwe ifamọ, lẹhinna gbe afẹfẹ gbẹ.Aworan ti a ṣe lori awọn akoj wọnyi ni lilo FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN ti n ṣiṣẹ ni 100 kV.Awọn aworan ti a gba silẹ ni x 26,500 ati x 43,000 magnifications nipa lilo Veleta 2k × 2k CCD kamẹra (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, Germany).Fun apẹẹrẹ kọọkan (n = 1), awọn aworan 10-15 ti gba silẹ.ImageJ (https://imagej.nih.gov/) ni a lo fun itupalẹ aworan ati wiwọn awọn iwọn ila opin okun (n = 100, awọn okun oriṣiriṣi).Prism 9 ni a lo lati ṣe awọn idanwo t-ti a ko ṣe pọ (tailed meji).Itumọ His-NT2RepCT ati NT fibrils jẹ 11.43 (SD 2.035) ati 7.67 (SD 1.389) nm, lẹsẹsẹ.Aarin igbẹkẹle (95%) jẹ -4.246 si -3.275.awọn iwọn ominira = 198, p <0.0001.
80 µl ti awọn ayẹwo omi ti o ni 10 µM thioflavin T (ThT) ni a wọn ni ẹẹmẹta (n = 3) labẹ awọn ipo aimi nipa lilo Corning 96-daradara dudu isalẹ awọn awo isalẹ (Corning Glass 3881, USA).Awọn iyatọ Fluorescence ni a gbasilẹ ni lilo àlẹmọ 440 nm kan ati àlẹmọ itujade 480 nm (FLUOStar Galaxy lati BMG Labtech, Offenburg, Jẹmánì).Ifihan agbara ThT ko kun tabi parun, nitori awọn idanwo pẹlu awọn ifọkansi oriṣiriṣi ti ThT ni a ṣe laisi iyipada kikankikan ifihan.Gbigbasilẹ gbigba silẹ ni 360 nm fun wiwọn haze.Fun awọn adanwo irugbin, 100 mg/mL gels ni a ṣẹda ni 37 ° C., tun da duro, ati lilo fun irugbin ni awọn ipin molar ti 5%, 10%, ati 20%.A ṣe atupale data nipa lilo Prism 9.
Thaw awọn akojopo His-NT2RepCT ati NT>100 mg/mL lori yinyin ki o ṣe àlẹmọ nipasẹ àlẹmọ 0.22 µm kan.A ṣe iṣiro awọn ifọkansi nipasẹ wiwọn gbigba ni 280 nm ni lilo Nandrop.Ni awọn kanga ti 96-daradara dudu ti kii ṣe abuda (Corning) pẹlu isalẹ ti o han, awọn ayẹwo ti fomi po si 20 mg / ml ni 20 mM Tris-HCl pH 8 ati adalu pẹlu 5 μM ThT (ipinnu ikẹhin), ifọkansi ayẹwo lapapọ. 50 μl iwọn didun.Awọn ayẹwo ni a yaworan ni gbogbo iṣẹju mẹwa 10 ni 37 °C lori microscope CellObserver (Zeiss) pẹlu ikanni ina ti a tan kaakiri ati ayọ FITC ati awọn eto àlẹmọ itujade fun aworan ThT.A lo lẹnsi 20x/0.4 fun aworan.Zen Blue (Zeiss) ati ImageJ (https://imagej.nih.gov/) ni a lo fun itupalẹ aworan.A tun pese awọn gels lati NT ati awọn ojutu His-NT2RepCT ni ifọkansi ti 50 mg/mL ti o ni 20 mM Tris pH 8 ati 5 µM ThT ati idabo ni 37 ° C fun awọn iṣẹju 90.Awọn ege gel ni a gbe lọ si kanga tuntun ti o ni 20 mM Tris, pH 8, ati 5 μM ThT ni dudu ti kii ṣe abuda 96 daradara ti o han gbangba awo isalẹ.Gba fluorescence alawọ ewe ati awọn aworan aaye didan ni titobi 20x/0.4.A lo ImageJ fun itupalẹ aworan.
Ojutu NMR sipekitira ni a gba ni 310 K lori 600 MHz Bruker Avance Neo spectrometer ti o ni ipese pẹlu QCI Quadrupole Resonance Pulsed Gradient Field Cryoprobe (HFCN).Awọn ayẹwo NMR ti o ni 10 mg/mL amuaradagba isokan ti aami pẹlu 13C, 15N, tituka ni 20 mM Tris-HCl (pH 8), 0.02% (w/v) NaN3, 5% DO (v/v), (n = 1) .Awọn iyipada kemikali ti NT2RepCT ni pH 6.7 ni a lo lati fi 23 tente oke ni irisi 2D ti 15N-HSQC.
Igun idán yiyi spectra NMR (MAS) to lagbara ti 13C, 15N-aami hydrogels ni a gbasilẹ sori Bruker Avance III HD spectrometer ni 800 MHz ti o ni ipese pẹlu 3.2 mm 13C/15N{1H} elekitironi kan.Ayẹwo iwọn otutu ni a ṣakoso ni lilo iwọn gaasi iwọn otutu ti o ni iyipada ni 277 K. Iwọn iwọn-meji dipole rotational resonance (DARR) 76 ati isọdọtun igbohunsafẹfẹ redio (RFDR) 77 spectra ni a gba ni awọn igbohunsafẹfẹ MAS ti 12.5 kHz ati 20 kHz, lẹsẹsẹ.Agbelebu polarization (CP) lati 1H si 13C ni a ṣe ni lilo rampu laini lati 60.0 si 48.0 kHz ni 1H, 61.3/71.6 kHz ni 13C (ni 12.5/20 kHz MAS) ati akoko olubasọrọ 0.5–1 ms.Spinal6478 decoupling ni 73.5 kHz ni a lo lakoko gbigba data.Akoko gbigba jẹ 10 milliseconds ati idaduro ọmọ jẹ awọn aaya 2.5.Awọn ibaṣepọ Cα/Cβ ti o ni asopọ ẹyọkan ti a ṣe akiyesi ni iwoye RFDR ni a yàn da lori iru awọn iṣipopada kẹmika abuda ti iwa ati isodipupo-isopọmọra ni iwoye DARR.
Ibi ipamọ data Zipper79 (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) ni a lo lati ṣe iṣiro awọn itesi flutter ati agbara Rosetta fun NT, NTFLSp, ati NTMiSp.Ibi ipamọ data Zipper ṣe iṣiro Rosetta Energy80, eyiti o ṣajọpọ ọpọlọpọ awọn iṣẹ agbara ọfẹ lati ṣe awoṣe ati itupalẹ igbekalẹ amuaradagba.Iwọn agbara ti -23 kcal / mol tabi isalẹ tọkasi ifarahan giga si fibrillate.Agbara isalẹ tumọ si iduroṣinṣin diẹ sii ti awọn okun β-meji ni ibamu idalẹnu.Ni afikun, Waltz algorithm ni a lo lati ṣe asọtẹlẹ awọn agbegbe amyloidogenic ni NT, NTFLSp ati NTMiSp Ref.81. (https://waltz.switchlab.org/).
Ojutu amuaradagba NT jẹ idapọ pẹlu 2- (N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) ifipamọ ni pH 5.5 ati 6.0 lati dinku pH si pH 6 ati 7, lẹsẹsẹ.Ifojusi amuaradagba ikẹhin jẹ 100 mg / milimita.
Awọn wiwọn ni a ṣe lori J-1500 CD spectrometer (JASCO, USA) nipa lilo cuvette 300 μL pẹlu ọna opopona ti 0.1 cm.Awọn ọlọjẹ ti fomi si 10 μM (n = 1) ni 20 mM phosphate buffer (pH 8).Lati ṣe itupalẹ iduroṣinṣin amuaradagba ni iwaju iyọ, awọn ọlọjẹ ni a ṣe atupale ni ifọkansi kanna (n = 1) ni 20 mM phosphate buffer (pH 8) ti o ni 154 mM NaF tabi NaCl, lẹsẹsẹ.Awọn iwoye iwọn otutu ni a gbasilẹ ni 222 nm lati 25°C si 95°C pẹlu iwọn alapapo ti 1°C/min.Iwọn ti awọn ọlọjẹ ti a ṣe pọ ni abinibi jẹ iṣiro nipa lilo agbekalẹ (KDmeasure – KDfinal)/(KDstart – KDfinal).Ni afikun, awọn iwoye marun ni a gbasilẹ fun ayẹwo kọọkan lati 260 nm si 190 nm ni 25°C ati lẹhin alapapo si 95°C.Sipekitira marun ni aropin, dan ati yi pada si molar ellipticity.A ṣe atupale data nipa lilo Prism 9.
Agbara fluorescence ti His-NT-GFP (300 mg/mL, 80 µL) ni a wọn ni ẹẹmẹta (n = 3) ni 96-daradara Corning farahan pẹlu isalẹ sihin dudu (Corning Glass 3881, USA) labẹ awọn ipo aimi.Ṣe iwọn awọn ayẹwo pẹlu oluka awo ti o da lori fluorescence pẹlu gigun gigun ti 395 nm ati ṣe igbasilẹ itujade ni 509 nm ṣaaju gelation ati awọn wakati 2 nigbamii ni 37°C.A ṣe atupale data pẹlu Prism 9.
Ohun elo iṣẹ idanwo purine nucleoside phosphorylase (ọna fluorometric, Sigma Aldrich) ni a lo ni ibamu si awọn itọnisọna olupese.Lati wiwọn iṣẹ ṣiṣe ni awọn gels ati awọn ojutu ti o ni His-NT-PNP, dapọ 10 ng ti His-NT-PNP pẹlu 100 mg/mL NT si iwọn didun lapapọ ti 2 µL nitori gel fun ifihan kan loke aarin wiwa ti ṣeto.Awọn iṣakoso fun awọn gels ati awọn solusan laisi His-NT-PNP ti wa pẹlu.Awọn wiwọn ni a ṣe lẹmeji (n = 2).Lẹhin ti iṣẹ-ṣiṣe ti wọnwọn, a ti yọ adalu lenu kuro ati pe gel ti ya aworan lati rii daju pe gel naa wa ni mimule lakoko wiwọn.A ṣe atupale data nipa lilo Prism 9.
Fun alaye diẹ sii lori apẹrẹ ikẹkọ, wo áljẹbrà ikẹkọ Iseda ti o sopọ mọ nkan yii.
Awọn nọmba 1 ati 2 ṣafihan data ibẹrẹ.1c, 2a–c, 3a, b, e–g, 4, 5b, d, f, ati 6, Awọn Ọpọtọ Afikun.3, afikun ọpọtọ.5a, d, àfikún ọpọtọ.6 ati afikun ọpọtọ.8. Data data lati iwadi yi ti wa ni ti gbalejo ni Zenodo database https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653.Awọn data NMR ti o gba ninu iwadi yii ni a fiweranṣẹ si ibi ipamọ BMRBig labẹ ID titẹsi bmrbig36.Awọn ẹya ti GFP ati PNP ni a gba lati PDB (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2).
Dide, A. ati Johansson, J. Yiyi siliki Spider Oríkĕ.Kemikali orilẹ-ede.isedale.11, 309-315 (2015).
Babb, PL et al.Ẹran ara-ara Nefila clavipes ṣe afihan oniruuru awọn jiini siliki alantakun ati ikosile idiju wọn.Genette orilẹ-ede.49, 895-903 (2017).