O ṣeun fun lilo si Nature.com.O nlo ẹya ẹrọ aṣawakiri kan pẹlu atilẹyin CSS lopin.Fun iriri ti o dara julọ, a ṣeduro pe ki o lo ẹrọ aṣawakiri imudojuiwọn kan (tabi mu Ipo Ibamu ṣiṣẹ ni Internet Explorer).Ni afikun, lati rii daju atilẹyin ti nlọ lọwọ, a fihan aaye naa laisi awọn aza ati JavaScript.
Sliders nfihan awọn nkan mẹta fun ifaworanhan.Lo awọn ẹhin ati awọn bọtini atẹle lati gbe nipasẹ awọn ifaworanhan, tabi awọn bọtini idari ifaworanhan ni ipari lati gbe nipasẹ ifaworanhan kọọkan.

317 Irin alagbara, irin okun ọpọn awọn olupese

Kemikali tiwqn tabili ti irin alagbara, irin ohun elo

SPACA6 jẹ amuaradagba oju-ara ti o han sperm ti o ṣe pataki fun isọpọ gamete lakoko ẹda ibalopo mammalian.Pelu ipa pataki yii, iṣẹ kan pato ti SPACA6 ko loye.A ṣe alaye ilana ti gara ti agbegbe extracellular ti SPACA6 ni ipinnu ti 2.2 Å, ti n ṣafihan amuaradagba-ibugbe meji ti o wa ninu lapapo oni-mẹrin ati awọn ounjẹ ipanu Ig-like ti o darapọ mọ nipasẹ awọn ọna asopọ quasi-flexible.Ẹya yii dabi IZUMO1, amuaradagba idapọ-ara gamete miiran, ṣiṣe SPACA6 ati IZUMO1 awọn ọmọ ẹgbẹ ti o ṣẹda ti superfamily ti awọn ọlọjẹ ti o ni ibatan idapọ ti a tọka si ninu rẹ bi IST superfamily.Idile superfamily IST jẹ asọye igbekale nipasẹ lapapo onipo mẹrin ti o ni yiyi ati bata CXXC ti o ni asopọ disulfide.Iwadi AlphaFold ti o da lori igbekalẹ ti proteome eniyan ṣe idanimọ awọn ọmọ ẹgbẹ amuaradagba afikun ti idile superfamily yii;ni pataki, ọpọlọpọ awọn ọlọjẹ wọnyi ni ipa ninu idapọ gamete.Ilana SPACA6 ati ibatan rẹ si awọn ọmọ ẹgbẹ miiran ti idile superfamily IST pese ọna asopọ ti o padanu ninu imọ wa ti idapọ gamete mammalian.
Gbogbo igbesi aye eniyan bẹrẹ pẹlu awọn ere haploid meji lọtọ: sperm baba ati ẹyin iya.Sugbọn yii jẹ olubori ti ilana yiyan ti o lagbara lakoko eyiti awọn miliọnu awọn sẹẹli sperm kọja nipasẹ ọna abe obinrin, bori ọpọlọpọ awọn idiwọ1 ati ki o faragba agbara, eyiti o mu iṣiṣẹ wọn pọ si ati ilana awọn paati oju-aye2,3,4.Paapa ti sperm ati oocyte ba wa ara wọn, ilana naa ko ti pari sibẹsibẹ.Oocyte ti yika nipasẹ ipele ti awọn sẹẹli cumulus ati idena glycoprotein ti a pe ni zona pellucida, nipasẹ eyiti sperm gbọdọ kọja lati wọ inu oocyte.Spermatozoa lo apapo awọn ohun elo adhesion dada ati ti o ni nkan ṣe pẹlu awọ ara ati awọn enzymu ti a fi pamọ lati bori awọn idena ikẹhin wọnyi5.Awọn ohun elo ati awọn enzymu wọnyi ni a fipamọ ni akọkọ sinu awọ ara inu ati matrix acrosomal ati pe a rii nigba ti awọ ara ita ti sperm ti wa ni lysed lakoko iṣesi acrosomal6.Igbesẹ ikẹhin ninu irin-ajo lile yii ni iṣẹlẹ idapọ ẹyin-sperm-egg, ninu eyiti awọn sẹẹli mejeeji dapọ awọn membran wọn lati di ohun-ara diploid kan ṣoṣo7.Botilẹjẹpe ilana yii jẹ ipilẹ-ilẹ ninu ẹda eniyan, awọn ibaraenisepo molikula pataki ko loye.
Ni afikun si idapọ gametes, kemistri ti idapọ ti awọn bilayers ọra meji ti ni iwadi lọpọlọpọ.Ni gbogbogbo, idapọ awọ ara jẹ ilana ti ko ni agbara ti o nilo ayase amuaradagba lati faragba iyipada isọdọtun igbekalẹ ti o mu awọn membran meji sunmọ papọ, fifọ itesiwaju wọn ati nfa fusion8,9.Awọn olutọpa amuaradagba wọnyi ni a mọ bi fusogens ati pe a ti rii ni awọn eto idapọ ainiye.Wọn nilo fun titẹsi gbogun ti sinu awọn sẹẹli agbalejo (fun apẹẹrẹ, gp160 ni HIV-1, iwasoke ninu awọn coronaviruses, hemagglutinin ninu awọn ọlọjẹ aarun ayọkẹlẹ) 10,11,12 placental (syncytin) 13,14,15 ati awọn idapọ-ara gamete ni awọn eukaryotes kekere ( HAP2/GCS1 ninu eweko, protists ati arthropods) 16,17,18,19.Awọn fusogens fun awọn ere ti eniyan ko tii ṣe awari, botilẹjẹpe ọpọlọpọ awọn ọlọjẹ ti han lati jẹ pataki fun asomọ gamete ati idapọ.CD9 ti a sọ oocyte, amuaradagba transmembrane ti a beere fun idapọ ti Asin ati awọn ere eniyan, ni akọkọ ti a ṣe awari 21,22,23.Botilẹjẹpe iṣẹ kongẹ rẹ ko ṣiyeju, ipa kan ninu ifaramọ, eto ti foci adhesion lori ẹyin microvilli, ati/tabi isọdi deede ti awọn ọlọjẹ dada oocyte dabi ẹnipe 24,25,26.Awọn ọlọjẹ aṣoju meji julọ ti o ṣe pataki fun isọdọkan gamete jẹ amuaradagba sperm IZUMO127 ati amuaradagba oocyte JUNO28, ati pe ẹgbẹ ẹlẹgbẹ wọn jẹ igbesẹ pataki ni idanimọ gamete ati ifaramọ ṣaaju idapọ.Okunrin Izumo1 knockout eku ati abo Juno knockout eku ni o wa patapata ailesabiyamo, ninu awọn awoṣe Sugbọn tẹ awọn perivitelline aaye sugbon gametes ko fiusi.Bakanna, confluence ti dinku nigbati a ṣe itọju awọn ere pẹlu egboogi-IZUMO1 tabi JUNO27,29 ninu awọn adanwo idapọ inu vitro ninu eniyan.
Laipe, ẹgbẹ tuntun ti a ṣe awari ti awọn ọlọjẹ ti a kosile ti sperm-phenotypically iru si IZUMO1 ati JUNO20,30,31,32,33,34,35 ni a ti ṣe awari.Ajẹmọ acrosomal membrane-sociated protein 6 (SPACA6) ti jẹ idanimọ bi pataki fun idapọ ninu iwadi mutagenesis murine ti o tobi.Fi sii transgene sinu apilẹṣẹ Spaca6 nmu awọn spermatozoa ti kii ṣe fufu, botilẹjẹpe spermatozoa wọnyi wọ inu aaye perivitelline 36.Awọn ẹkọ ikọlu ti o tẹle ni awọn eku jẹrisi pe Spaca6 nilo fun idapọ gamete 30,32.SPACA6 ti fẹrẹẹ jẹ iyasọtọ ni awọn idanwo ati pe o ni ilana isọdi ti o jọra si ti IZUMO1, eyun laarin intima ti spermatozoa ṣaaju iṣesi acrosomal, ati lẹhinna lọ si agbegbe equatorial lẹhin iṣesi acrosomal 30,32.Spaca6 homologues wa ni orisirisi awọn osin ati awọn miiran eukaryotes 30 ati awọn oniwe-pataki fun eda eniyan gamete fusion ti a ti afihan nipa idinamọ ti eda eniyan idapọ ni vitro nipa resistance to SPACA6 30.Ko dabi IZUMO1 ati JUNO, awọn alaye ti igbekalẹ, awọn ibaraenisepo, ati iṣẹ ti SPACA6 ko ṣiyemọ.
Lati ni oye diẹ sii ilana ipilẹ ti o wa labẹ idapọ ti sperm eniyan ati awọn ẹyin, eyiti yoo jẹ ki a sọ fun awọn idagbasoke iwaju ni igbero idile ati itọju irọyin, a ṣe SPACA6 igbekale ati awọn ikẹkọ biokemika.Ẹya gara ti agbegbe extracellular ti SPACA6 ṣe afihan lapapo mẹrin-helical (4HB) ati agbegbe imunoglobulin-like (Ig-like) ti o ni asopọ nipasẹ awọn agbegbe ti o ni irọrun.Gẹgẹbi a ti sọ tẹlẹ ninu awọn ẹkọ iṣaaju, 7,32,37 eto-ašẹ ti SPACA6 jẹ iru si ti eniyan IZUMO1, ati pe awọn ọlọjẹ meji pin ipin kan ti ko wọpọ: 4HB pẹlu oju ilẹ helical triangular ati bata ti awọn idii CXXC ti o ni asopọ disulfide.A daba pe IZUMO1 ati SPACA6 ni bayi ṣalaye nla kan, superfamily ti o ni ibatan igbekale ti awọn ọlọjẹ ti o ni nkan ṣe pẹlu idapọ gamete.Lilo awọn ẹya alailẹgbẹ si idile superfamily, a ṣe iwadii pipe fun proteome igbekalẹ eniyan AlphaFold, idamọ awọn ọmọ ẹgbẹ afikun ti idile superfamily yii, pẹlu ọpọlọpọ awọn ọmọ ẹgbẹ ti o ni ipa ninu idapọ gamete ati/tabi idapọ.O han ni bayi pe agbo igbekalẹ ti o wọpọ ati idile superfamily ti awọn ọlọjẹ ti o ni nkan ṣe pẹlu idapọ gamete, ati pe eto wa n pese maapu molikula ti abala pataki yii ti ẹrọ idapọ gamete eniyan.
SPACA6 jẹ amuaradagba transmembrane kan-kọja kan pẹlu glycan ti o ni asopọ N-kan ati awọn iwe adehun disulfide putative mẹfa (Awọn eeya S1a ati S2).A ṣe afihan ašẹ extracellular ti SPACA6 eniyan (awọn iyokù 27-246) ninu awọn sẹẹli Drosophila S2 ati sọ di mimọ nipa lilo isunmọ nickel, paṣipaarọ cation, ati chromatography imukuro iwọn (Fig. S1b).SPACA6 ectodomain ti a sọ di mimọ jẹ iduroṣinṣin pupọ ati isokan.Onínọmbà nipa lilo chromatography iyasoto iwọn ni idapo pẹlu pipinka ina polygonal (SEC-MALS) ṣafihan tente oke kan pẹlu iwuwo molikula ti 26.2 ± 0.5 kDa (Fig. S1c).Eyi ni ibamu pẹlu iwọn SPACA6 monomeric ectodomain, ti o nfihan pe oligomerization ko waye lakoko isọdọmọ.Ni afikun, spectroscopy dichroism ipin (CD) ṣe afihan ipilẹ α / β ti o dapọ pẹlu aaye yo ti 51.3 °C (Fig. S1d, e).Deconvolution of the CD spectra fi han 38.6% α-helical ati 15.8% β-stranded eroja (Figure S1d).
SPACA6 ectodomain ti wa ni crystallized lilo ID matrix seeding38 Abajade ni a ṣeto data pẹlu ipinnu ti 2.2 Å (Table 1 ati Figure S3).Lilo apapo ti aropo molikula ti o da lori ajẹkù ati data ipasẹ SAD pẹlu ifihan bromide fun ipinnu igbekalẹ (Table 1 ati Figure S4), awoṣe isọdọtun ikẹhin ni awọn iṣẹku 27-246.Ni akoko ipinnu eto naa, ko si esiperimenta tabi awọn ẹya AlphaFold ti o wa.SPACA6 ectodomain ṣe iwọn 20 Å × 20 Å × 85 Å, ni awọn helices meje ati awọn β-strands mẹsan, ati pe o ni agbo-iwe giga elongated ti o ni iduroṣinṣin nipasẹ awọn iwe adehun disulfide mẹfa (Fig. 1a, b).Awọn iwuwo elekitironi ti ko lagbara ni opin ẹwọn ẹgbẹ Asn243 tọkasi pe iyoku yii jẹ glycosylation ti o ni asopọ N.Ẹya naa ni awọn ibugbe meji: N-terminal mẹrin-helix lapapo (4HB) ati agbegbe C-terminal Ig-like pẹlu agbegbe mitari agbedemeji laarin wọn (Fig. 1c).
Ilana ti agbegbe extracellular ti SPACA6.Aworan yiya ti agbegbe extracellular ti SPACA6, awọ ti pq lati N si C-terminus lati buluu dudu si pupa dudu.Cysteines ti o ni ipa ninu awọn ifunmọ disulfide jẹ afihan ni magenta.b Topology ti agbegbe extracellular ti SPACA6.Lo ilana awọ kanna bi ni Figure 1a.c SPACA6 extracellular ase.4HB, mitari, ati awọn shatti adikala agbegbe Ig-bi jẹ osan awọ, alawọ ewe, ati buluu, lẹsẹsẹ.Awọn ipele ko ni fa si iwọn.
Agbegbe 4HB ti SPACA6 pẹlu awọn helices akọkọ mẹrin (helices 1-4), eyiti a ṣeto ni irisi helix helical (Fig. 2a), yiyi laarin awọn ibaraẹnisọrọ antiparallel ati parallel (Fig. 2b).A kekere afikun ọkan-Tan Helix (helix 1′) ti wa ni gbe papẹndicular si awọn lapapo, lara onigun mẹta pẹlu helices 1 ati 2. Eleyi onigun mẹta ti wa ni die-die dibajẹ ninu awọn helical-lilọ packing ti awọn jo ipon packing ti helices 3 ati 4 ( aworan 2a).
4HB N-ebute rinhoho chart.b Iwo oke ti opo kan ti awọn helices mẹrin, helix kọọkan ni afihan ni buluu dudu ni N-terminus ati pupa dudu ni C-terminus.c Aworan kẹkẹ ajija ti oke-isalẹ fun 4HB, pẹlu aloku kọọkan ti o han bi Circle ti a samisi pẹlu koodu amino acid lẹta kan;nikan awọn mẹrin amino acids ni oke kẹkẹ ti wa ni kà.Awọn iṣẹku ti kii ṣe pola jẹ awọ ofeefee, awọn iṣẹku ti ko ni agbara pola jẹ awọ alawọ ewe, awọn iṣẹku ti o ni agbara daadaa jẹ awọ buluu, ati awọn iṣẹku ti ko ni agbara jẹ awọ pupa.d Awọn oju onigun mẹta ti agbegbe 4HB, pẹlu awọn 4HB ni osan ati awọn mitari ni alawọ ewe.Mejeeji insets fihan ọpá-sókè disulfide ìde.
4HB ti wa ni ogidi lori ohun akojọpọ hydrophobic mojuto kq o kun ti aliphatic ati aroma awọn iṣẹku (Fig. 2c).Ipilẹ naa ni asopọ disulfide laarin Cys41 ati Cys55 ti o so awọn helices 1 ati 2 papọ ni igun onigun oke (Fig. 2d).Awọn ifunmọ disulfide meji ni a ṣẹda laarin ero CXXC ni Helix 1 'ati ero CXXC miiran ti a rii ni ipari ti β-hairpin ni agbegbe hinge (Fig. 2d).Aloku arginine Konsafetifu pẹlu iṣẹ aimọ (Arg37) wa ni inu onigun mẹta ti o ṣofo ti a ṣẹda nipasẹ awọn helices 1′, 1, ati 2. Aliphatic carbon awọn ọta Cβ, Cγ, ati Cδ Arg37 ṣe ajọṣepọ pẹlu mojuto hydrophobic, ati awọn ẹgbẹ guanidine rẹ ni gigun kẹkẹ. laarin awọn helices 1 'ati 1 nipasẹ awọn ibaraẹnisọrọ laarin ẹhin Thr32 ati ẹwọn ẹgbẹ (Fig. S5a, b).Tyr34 fa sinu iho ti nlọ awọn iho kekere meji nipasẹ eyiti Arg37 le ṣe ajọṣepọ pẹlu epo.
Awọn ibugbe β-sandwich Ig-like jẹ idile superfamily ti awọn ọlọjẹ ti o pin ẹya ti o wọpọ ti meji tabi diẹ ẹ sii ti o ni ibatan si amphipathic β-sheets ti o ni ibatan nipasẹ mojuto hydrophobic 39. Agbegbe C-terminal Ig-like ti SPACA6 ni ilana kanna. ati ki o oriširiši meji fẹlẹfẹlẹ (Fig. S6a).Sheet 1 jẹ β-sheet ti awọn okun mẹrin (awọn okun D, ​​F, H, ati I) nibiti awọn okun F, H, ati pe Mo ṣe agbekalẹ eto alatako, ati awọn okun I ati D mu ibaraenisepo ti o jọra.Tabili 2 jẹ iwe kekere ti o ni ilodisi-ni afiwe-meji beta (awọn okun E ati G).A ṣe akiyesi asopọ disulfide inu laarin C-terminus ti pq E ati aarin ti pq H (Cys170-Cys226) (Fig. S6b).Idemọ disulfide yii jẹ afiwe si mnu disulfide ni agbegbe β-sandwich ti immunoglobulin40,41.
β-dì-okun mẹrin-okun yipo ni gbogbo ipari rẹ, ti o n ṣe awọn egbegbe asymmetrical ti o yatọ ni apẹrẹ ati awọn elekitirotaki.Awọn tinrin eti ni a alapin hydrophobic ayika dada ti o dúró jade akawe si awọn ti o ku uneven ati electrostatically Oniruuru roboto ni SPACA6 (Fig. S6b, c).Halo ti awọn ẹgbẹ ẹhin carbonyl/amino ti o han ati awọn ẹwọn ẹgbẹ pola yika dada hydrophobic (Fig. S6c).Ala ti o gbooro ni aabo nipasẹ apa helical capped ti o dina apakan N-terminal ti mojuto hydrophobic ati pe o ṣe awọn iwe adehun hydrogen mẹta pẹlu ẹgbẹ pola ti o ṣii ti ẹhin pq F (Fig. S6d).Ipin C-terminal ti eti yii jẹ apo nla kan pẹlu mojuto hydrophobic ti o han ni apakan.Apo naa ti yika nipasẹ awọn idiyele rere nitori awọn ipilẹ mẹta ti awọn iṣẹku arginine meji (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 ati Arg212-Arg214) ati histidine aringbungbun (His220) (Figure S6e).
Ẹkun hinge jẹ apakan kukuru laarin agbegbe helical ati agbegbe Ig-like, ti o ni β-Layer antiparallel mẹta-okun mẹta (awọn okun A, B ati C), helix 310 kekere kan, ati ọpọlọpọ awọn apakan helical laileto gigun.(aworan S7).Nẹtiwọọki ti covalent ati awọn olubasọrọ elekitirotatiki ni agbegbe mitari han lati ṣe imuduro iṣalaye laarin 4HB ati agbegbe Ig-like.Nẹtiwọọki le pin si awọn ẹya mẹta.Apa akọkọ pẹlu awọn idii CXXC meji (27CXXC30 ati 139CXXC142) ti o ṣe bata meji ti awọn iwe adehun disulfide laarin β-hairpin ni mitari ati 1′ helix ni 4HB.Apa keji pẹlu awọn ibaraenisepo elekitirotiki laarin agbegbe Ig-like ati mitari.Glu132 ni mitari ṣe afara iyọ kan pẹlu Arg233 ni agbegbe Ig-like ati Arg135 ni mitari.Apa kẹta pẹlu ifunmọ covalent laarin agbegbe Ig-like ati agbegbe mitari.Awọn ifunmọ disulfide meji (Cys124-Cys147 ati Cys128-Cys153) so lupu hinge pọ si ọna asopọ ti o jẹ iduroṣinṣin nipasẹ awọn ibaraenisepo elekitiroti laarin Gln131 ati ẹgbẹ iṣẹ-ẹhin, gbigba iraye si agbegbe Ig-like akọkọ.pq.
Ilana ti SPACA6 ectodomain ati awọn ẹya ara ẹni kọọkan ti 4HB ati awọn agbegbe Ig-like ni a lo lati wa awọn igbasilẹ ti o jọra ni awọn apoti isura data amuaradagba 42.A ṣe idanimọ awọn ere-kere pẹlu awọn ikun Dali Z ti o ga, awọn iyapa boṣewa kekere, ati awọn ikun LALI nla (igbẹhin jẹ nọmba awọn iṣẹku ti iṣeto deede).Lakoko ti 10 akọkọ deba lati wiwa ectodomain kikun (Table S1) ni itẹwọgba Z-score ti> 842, wiwa fun 4HB tabi agbegbe Ig-like nikan fihan pe pupọ julọ awọn hits wọnyi ni ibamu si β-sandwiches nikan.agbo ibi gbogbo ti a rii ni ọpọlọpọ awọn ọlọjẹ.Gbogbo awọn wiwa mẹta ni Dali da esi kan ṣoṣo pada: IZUMO1.
O ti pẹ ni imọran pe SPACA6 ati IZUMO1 pin awọn ibajọra igbekalẹ7,32,37.Botilẹjẹpe awọn ectodomains ti awọn ọlọjẹ ti o ni nkan meji gamete fusion pin nikan 21% idanimọ ọkọọkan (Figure S8a), ẹri idiju, pẹlu ilana isunmọ disulfide ti a fipamọ ati agbegbe C-terminal Ig-like ti asọtẹlẹ ni SPACA6, gba awọn igbiyanju kutukutu lati kọ kan homology awoṣe ti A a SPACA6 eku lilo IZUMO1 bi a template37.Eto wa jẹrisi awọn asọtẹlẹ wọnyi ati ṣafihan iwọn tootọ ti ibajọra.Ni otitọ, awọn ẹya SPACA6 ati IZUMO137,43,44 pin ipin kannaa ile-iṣẹ meji-ašẹ (Fig. S8b) pẹlu iru 4HB ati Ig-like β-sandwich domain ti o ni asopọ nipasẹ agbegbe hinge (Fig. S8c).
IZUMO1 ati SPACA6 4HB ni awọn iyatọ ti o wọpọ lati awọn idii ajija ti aṣa.Aṣoju 4HBs, gẹgẹbi awọn ti a ri ni awọn ile-iṣẹ amuaradagba SNARE ti o ni ipa ninu idapọ endosomal 45,46, ni awọn helices ti o ni aaye ti o ni deede ti o n ṣetọju iṣipopada igbagbogbo ni ayika igun-aarin 47. Ni idakeji, awọn ibugbe helical ni mejeeji IZUMO1 ati SPACA6 ti daru, pẹlu iyipada iyipada ati iṣakojọpọ aiṣedeede (olusin S8d).Yiyi, o ṣee ṣe nipasẹ onigun mẹta ti a ṣẹda nipasẹ helices 1′, 1 ati 2, wa ni idaduro ni IZUMO1 ati SPACA6 ati imuduro nipasẹ ero CXXC kanna lori helix 1′.Sibẹsibẹ, afikun disulfide ti a rii ni SPACA6 (Cys41 ati Cys55 covalently linking helices 1 ati 2 loke) ṣẹda apex didasilẹ ni apex onigun mẹta, ti o jẹ ki SPACA6 yiyi diẹ sii ju IZUMO1, pẹlu awọn igun mẹtẹẹta iho ti o sọ diẹ sii.Ni afikun, IZUMO1 ko ni Arg37 ti a ṣe akiyesi ni aarin iho yii ni SPACA6.Ni idakeji, IZUMO1 ni ipilẹ hydrophobic aṣoju diẹ sii ti aliphatic ati awọn iṣẹku aromatic.
IZUMO1 ni agbegbe Ig-bi ti o ni okun-meji ati β-sheet43 ti o ni okun marun.Okun afikun ni IZUMO1 rọpo okun ni SPACA6, eyiti o ṣe ajọṣepọ pẹlu okun F lati ṣe idinwo awọn ifunmọ hydrogen ẹhin ninu okun naa.Ojuami ifarabalẹ ti o nifẹ si ni idiyele dada ti asọtẹlẹ ti awọn agbegbe Ig-like ti awọn ọlọjẹ meji.Ipilẹ IZUMO1 jẹ idiyele odi diẹ sii ju aaye SPACA6 lọ.Afikun idiyele wa nitosi C-terminus ti nkọju si awọ ara sperm.Ni SPACA6, awọn agbegbe kanna jẹ didoju diẹ sii tabi idiyele daadaa (Fig. S8e).Fun apẹẹrẹ, dada hydrophobic (awọn eti tinrin) ati awọn pits ti o daadaa (awọn eti gbooro) ni SPACA6 ti gba agbara ni odi ni IZUMO1.
Botilẹjẹpe ibatan ati awọn eroja igbekalẹ keji laarin IZUMO1 ati SPACA6 ti wa ni ipamọ daradara, titọpa iṣeto ti awọn agbegbe Ig-like fihan pe awọn agbegbe mejeeji yatọ ni iṣalaye gbogbogbo wọn ni ibatan si ara wọn (Fig. S9).Lapapo ajija ti IZUMO1 ti wa ni titan nipa β-sandiwichi, ṣiṣẹda apẹrẹ “boomerang” ti a ti ṣapejuwe tẹlẹ ni iwọn 50 ° lati ipo aarin.Ni idakeji, ina ti o wa ni helical ni SPACA6 ti wa ni titan nipa 10 ° ni ọna idakeji.Awọn iyatọ ninu awọn iṣalaye wọnyi ṣee ṣe nitori awọn iyatọ ninu agbegbe mitari.Ni ipele ọkọọkan akọkọ, IZUMO1 ati SPACA6 pin ibajọra kekere ti o tẹle ni mitari, pẹlu ayafi ti cysteine, glycine, ati awọn iyokù aspartic acid.Bi abajade, awọn ifunmọ hydrogen ati awọn nẹtiwọọki electrostatic yatọ patapata.β-sheet Atẹle awọn eroja ti wa ni pinpin nipasẹ IZUMO1 ati SPACA6, biotilejepe awọn ẹwọn ni IZUMO1 gun pupọ ati pe 310 helix (helix 5) jẹ alailẹgbẹ si SPACA6.Awọn iyatọ wọnyi ja si ni awọn iṣalaye agbegbe oriṣiriṣi fun awọn ọlọjẹ meji bibẹẹkọ ti o jọra.
Wiwa olupin Dali wa ṣafihan pe SPACA6 ati IZUMO1 jẹ awọn ẹya meji ti a pinnu idanwo idanwo ti o fipamọ sinu data data amuaradagba ti o ni agbo 4HB pato (Table S1).Laipẹ diẹ, DeepMind (Alfabeti/Google) ti ni idagbasoke AlphaFold, eto orisun nẹtiwọọki ti o le ṣe asọtẹlẹ deede awọn ẹya 3D ti awọn ọlọjẹ lati awọn ilana akọkọ48.Laipẹ lẹhin ti a yanju eto SPACA6, data data AlphaFold ti tu silẹ, n pese awọn awoṣe igbekalẹ asọtẹlẹ ti o bo 98.5% ti gbogbo awọn ọlọjẹ ninu proteome eniyan48,49.Lilo igbekalẹ SPACA6 ipinnu wa bi awoṣe wiwa, wiwa homology igbekalẹ fun awoṣe ni AlphaFold eniyan proteome ṣe idanimọ awọn oludije pẹlu awọn ibajọra igbekalẹ ti o ṣeeṣe si SPACA6 ati IZUMO1.Fi fun iṣedede iyalẹnu ti AlphaFold ni asọtẹlẹ SPACA6 (Fig. S10a) - paapaa 1.1 Å rms ectodomain ti a ṣe afiwe si eto ipinnu wa (Fig. S10b) - a le ni igboya pe awọn ere-kere SPACA6 ti a mọ ni o ṣeeṣe lati jẹ deede.
Ni iṣaaju, PSI-BLAST wa iṣupọ IZUMO1 pẹlu awọn ọlọjẹ mẹta miiran ti o ni ibatan sperm: IZUMO2, IZUMO3, ati IZUMO450.AlphaFold sọtẹlẹ pe awọn ọlọjẹ idile IZUMO wọnyi ṣe agbo sinu agbegbe 4HB pẹlu apẹrẹ isunmọ disulfide kanna bi IZUMO1 (Awọn eeya 3a ati S11), botilẹjẹpe wọn ko ni agbegbe Ig-like kan.O ti wa ni idawọle pe IZUMO2 ati IZUMO3 jẹ awọn ọlọjẹ awọ-ara kan ti o jọra si IZUMO1, lakoko ti IZUMO4 han pe o wa ni ipamọ.Awọn iṣẹ ti IZUMO 2, 3, ati awọn ọlọjẹ 4 ni idapọ gamete ko ti pinnu.IZUMO3 ni a mọ lati ṣe ipa kan ninu biogenesis acrosome lakoko idagbasoke spermatozoa51, ati amuaradagba IZUMO ṣe eka50.Itoju ti awọn ọlọjẹ IZUMO ni awọn ẹran-ọsin, awọn ẹranko, ati awọn amphibians ni imọran pe iṣẹ agbara wọn wa ni ibamu pẹlu ti awọn ọlọjẹ miiran ti o ni ibatan gamete-fusion, gẹgẹbi DCST1/2, SOF1, ati FIMP.
Aworan atọka ti ile faaji ti idile superfamily IST, pẹlu 4HB, mitari, ati awọn ibugbe bii Ig ti o ṣe afihan ni osan, alawọ ewe, ati buluu, lẹsẹsẹ.IZUMO4 ni agbegbe C-terminal alailẹgbẹ ti o dabi dudu.Awọn iwe ifowopamosi disulfide ti a fọwọsi ati putative jẹ afihan nipasẹ awọn laini to lagbara ati aami, ni atele.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-Fold): AF-Q1ZYL8-Fold DB: AF-Q1ZYL8-F1): AF-Q1ZYL8-F1): AF-Q3KNT9-F1) ti han ni iwọn awọ kanna bi nronu A. Awọn iwe ifowopamosi Disulfide ti han ni magenta.TMEM95, IZUMO2 ati IZUMO3 awọn helice transmembrane ko ṣe afihan.
Ko dabi amuaradagba IZUMO, awọn ọlọjẹ SPACA miiran (ie, SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5, ati SPACA9) ni a ro pe o yatọ si igbekale si SPACA6 (Fig. S12).SPACA9 nikan ni o ni 4HB, ṣugbọn a ko nireti lati ni iru-iṣalaye-egboogi-parallel ti o jọra tabi asopọ disulfide kanna bi SPACA6.SPACA1 nikan ni o ni iru agbegbe Ig-like.AlphaFold sọtẹlẹ pe SPACA3, SPACA4 ati SPACA5 ni eto ti o yatọ patapata ju SPACA6.O yanilenu, SPACA4 tun mọ lati ṣe ipa ninu idapọ, ṣugbọn si iwọn ti o tobi ju SPACA6 lọ, dipo irọrun ibaraenisepo laarin sperm ati oocyte zona pellucida52.
Iwadi AlphaFold wa ti rii ibaamu miiran fun IZUMO1 ati SPACA6 4HB, TMEM95.TMEM95, amuaradagba transmembrane kan pato-sperm kan, sọ awọn eku akọ di alailebi nigbati a ba parẹ 32,33.Spermatozoa ti ko ni TMEM95 ni deede mofoloji, motility, ati agbara lati wọ inu zona pellucida ati dipọ mọ awọ awo ẹyin, ṣugbọn ko le dapọ pẹlu awọ ara oocyte.Awọn ijinlẹ iṣaaju ti fihan pe TMEM95 pin awọn ibajọra igbekalẹ pẹlu IZUMO133.Nitootọ, awoṣe AlphaFold jẹrisi pe TMEM95 jẹ 4HB pẹlu bata kanna ti CXXC motifs bi IZUMO1 ati SPACA6 ati imudani disulfide afikun kanna laarin awọn helices 1 ati 2 ti a rii ni SPACA6 (Fig. 3a ati S11).Botilẹjẹpe TMEM95 ko ni agbegbe Ig-like, o ni agbegbe ti o ni ilana isunmọ disulfide ti o jọra si awọn agbegbe SPACA6 ati IZUMO1 hinge (Fig. 3b).Ni akoko titẹjade iwe afọwọkọ yii, olupin ti a ti fiweranṣẹ ṣe ijabọ igbekalẹ ti TMEM95, ti o jẹrisi abajade AlphaFold53.TMEM95 jẹ iru pupọ si SPACA6 ati IZUMO1 ati pe o ti fipamọ itankalẹ tẹlẹ ninu awọn amphibian (Fig. 4 ati S13).
Iwadi PSI-BLAST lo NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP, ati awọn apoti isura infomesonu SOF1 lati pinnu ipo awọn ilana wọnyi ninu igi igbesi aye.Awọn aaye laarin awọn aaye ẹka ko han si iwọn.
Ijọra igbekalẹ gbogbogbo ti o yanilenu laarin SPACA6 ati IZUMO1 ni imọran pe wọn jẹ awọn ọmọ ẹgbẹ idasile ti superfamily igbekalẹ ti a fipamọ ti o pẹlu TMEM95 ati IZUMO 2, 3, ati awọn ọlọjẹ 4.mọ omo egbe: IZUMO1, SPACA6 ati TMEM95.Nitoripe awọn ọmọ ẹgbẹ diẹ nikan ni o ni awọn ibugbe Ig-like, ami iyasọtọ ti idile superfamily IST ni agbegbe 4HB, eyiti o ni awọn ẹya alailẹgbẹ ti o wọpọ si gbogbo awọn ọlọjẹ wọnyi: 1) Coiled 4HB pẹlu awọn helices ti a ṣeto ni ilodisi-parallel/parallel (Ọpọtọ) 5a), 2) idii naa ni oju onigun mẹta ti o ni awọn helices meji laarin lapapo ati helix inaro kẹta (apapọ bọtini agbegbe (Fig. 5c) CXXC motif, ti a ri ni awọn ọlọjẹ thioredoxin, ni a mọ lati ṣiṣẹ. bi sensọ redox 54,55,56, lakoko ti idii ninu awọn ọmọ ẹgbẹ idile IST le ni nkan ṣe pẹlu amuaradagba disulfide isomerases gẹgẹbi ERp57 ni idapo gamete. Awọn ipa ni nkan ṣe pẹlu 57,58.
Awọn ọmọ ẹgbẹ ti idile superfamily IST jẹ asọye nipasẹ awọn ẹya abuda mẹta ti agbegbe 4HB: awọn helice mẹrin ti o yipada laarin iru ati iṣalaye antiparallel, awọn oju lapapo helical ba-triangular, ati idii ilọpo meji CXXC ti a ṣẹda laarin awọn ohun elo kekere.) N-terminal helixes (osan) ati agbegbe mitari β-hairpin (alawọ ewe).
Fun ibajọra laarin SPACA6 ati IZUMO1, agbara ti iṣaaju lati sopọ mọ IZUMO1 tabi JUNO ni idanwo.Biolayer interferometry (BLI) jẹ ọna asopọ orisun-kinetic ti o ti lo tẹlẹ lati ṣe iwọn ibaraenisepo laarin IZUMO1 ati JUNO.Lẹhin ifasilẹ ti sensọ ti a fi aami si biotin pẹlu IZUMO1 bi bait pẹlu ifọkansi giga ti JUNO analyte, a ti ri ifihan agbara ti o lagbara (Fig. S14a), ti o ṣe afihan iyipada ti o ni asopọ ni sisanra ti biomaterial ti a so si imọran sensọ.Awọn ifihan agbara ti o jọra (ie, JUNO pọ mọ sensọ bi ìdẹ lodi si IZUMO1 analyte) (Fig. S14b).Ko si ifihan agbara ti a rii nigbati SPACA6 ti lo bi itupale lodi si IZUMO1 ti o ni asopọ sensọ tabi sensọ-odidi JUNO (Figure S14a,b).Aisi ifihan agbara yii tọkasi pe agbegbe extracellular ti SPACA6 ko ni ajọṣepọ pẹlu agbegbe extracellular ti IZUMO1 tabi JUNO.
Nitoripe ayẹwo BLI ti da lori biotinylation ti awọn iṣẹku lysine ọfẹ lori amuaradagba bait, iyipada yii le ṣe idiwọ idina ti awọn iyokù lysine ba ni ipa ninu ibaraenisepo.Ni afikun, iṣalaye ti isunmọ ibatan si sensọ le ṣẹda awọn idiwọ sitẹri, nitorinaa awọn igbelewọn fa-isalẹ ti aṣa tun ṣe lori SPACA6 recombinant, IZUMO1 ati JUNO ectodomains.Bi o ti lẹ jẹ pe eyi, SPACA6 ko ṣafẹri pẹlu IZUMO1 ti o ni aami-Tagged tabi JUNO (Fig. S14c, d), ti o ṣe afihan ko si ibaraenisepo ti o ni ibamu pẹlu eyiti a ṣe akiyesi ni awọn idanwo BLI.Gẹgẹbi iṣakoso rere, a jẹrisi ibaraenisepo ti JUNO pẹlu aami rẹ IZUMO1 (Awọn nọmba S14e ati S15).
Pelu ibajọra igbekalẹ laarin SPACA6 ati IZUMO1, ailagbara ti SPACA6 lati di JUNO kii ṣe iyalẹnu.Ipilẹ ti eniyan IZUMO1 ni diẹ sii ju awọn iṣẹku 20 ti o nlo pẹlu JUNO, pẹlu awọn iṣẹku lati ọkọọkan awọn agbegbe mẹta (biotilejepe ọpọlọpọ ninu wọn wa ni agbegbe mitari) (Fig. S14f).Ninu awọn iṣẹku wọnyi, ọkan nikan ni o tọju ni SPACA6 (Glu70).Lakoko ti ọpọlọpọ awọn aropo aloku ṣe idaduro awọn ohun-ini biokemika atilẹba wọn, aloku Arg160 pataki ni IZUMO1 ti rọpo nipasẹ Asp148 ti ko ni idiyele ni SPACA6;Awọn ijinlẹ iṣaaju ti fihan pe iyipada Arg160Glu ni IZUMO1 fẹrẹ parẹ patapata ni abuda si JUNO43.Ni afikun, iyatọ ninu iṣalaye agbegbe laarin IZUMO1 ati SPACA6 ṣe pataki pọ si agbegbe agbegbe ti aaye JUNO-abuda ti agbegbe deede lori SPACA6 (Fig. S14g).
Pelu iwulo ti a mọ fun SPACA6 fun idapọ gamete ati ibajọra rẹ si IZUMO1, SPACA6 ko han pe o ni iṣẹ isọdọkan JUNO deede.Nitorinaa, a ti wa lati darapọ data igbekalẹ wa pẹlu ẹri pataki ti a pese nipasẹ isedale itankalẹ.Tito lẹsẹsẹ ti SPACA6 homologues ṣe afihan itoju ti ọna ti o wọpọ ju awọn ẹranko lọ.Fun apẹẹrẹ, awọn iṣẹku cysteine ​​wa paapaa ni awọn amphibian ti o ni ibatan ti o jina (Fig. 6a).Lilo olupin ConSurf, data idaduro titete lẹsẹsẹ ọpọ ti awọn ilana 66 ni a ya aworan si oju SPACA6.Iru onínọmbà yii le ṣafihan iru awọn iṣẹku ti a ti fipamọ lakoko itankalẹ amuaradagba ati pe o le tọka iru awọn agbegbe dada ṣe ipa ninu iṣẹ.
Tito lẹsẹsẹ ti SPACA6 ectodomains lati oriṣiriṣi oriṣiriṣi mejila ti a pese sile nipa lilo CLUSTAL OMEGA.Gẹgẹbi itupalẹ ConSurf, awọn ipo Konsafetifu julọ ti samisi ni buluu.Awọn iṣẹku Cysteine ​​​​ti ṣe afihan ni pupa.Awọn aala agbegbe ati awọn eroja igbekalẹ keji jẹ afihan ni oke ti titete, nibiti awọn itọka tọkasi awọn okun-β ati awọn igbi tọkasi awọn helices.Awọn Idanimọ Wiwọle NCBI ti o ni awọn itọsẹ naa ni: eniyan (Homo sapiens, NP_001303901), mandrill (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), ọbọ capuchin (Cebus mimic, XP_017359366), ẹṣin (Equus01le killer) 23 XP_032_034).), agutan (Ovis aries, XP_014955560), erin (Loxodonta africana, XP_010585293), aja (Canis lupus familyis, XP_025277208), eku (Mus musculus, NP_001156381), Tasmanian devil (31995277208), Tasmanian devil , 8) , 61_89 ati Bullfrog (Bufo bufo, XP_040282113).Nọmba naa da lori aṣẹ eniyan.b Aṣoju oju ti eto SPACA6 pẹlu 4HB ni oke ati agbegbe Ig-like ni isalẹ, awọn awọ ti o da lori awọn iṣiro itọju lati ọdọ olupin ConSurf.Awọn ẹya ti o dara ju ti o dara julọ wa ni buluu, awọn ẹya ti o wa niwọntunwọnsi wa ni funfun, ati awọn ti o kere julọ ti o wa ni awọ ofeefee.cysteine ​​eleyi ti.Awọn abulẹ dada mẹta ti n ṣe afihan ipele giga ti aabo ni a fihan ninu inset ti a samisi awọn abulẹ 1, 2 ati 3. Aworan efe 4HB kan han ni inset ni oke apa ọtun (Eto awọ kanna).
Ilana SPACA6 ni awọn agbegbe dada mẹta ti o ni aabo pupọ (Fig. 6b).Patch 1 pan 4HB ati agbegbe mitari ati pe o ni awọn afara disulfide CXXC meji ti a fipamọ, Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 nẹtiwọọki mitari (Fig. S7), ati awọn iṣẹku oorun oorun ita mẹta ti a fipamọ (Phe31, Tyr73, Phe137).rimu ti o gbooro ti agbegbe Ig-like (Fig. S6e), eyiti o duro fun ọpọlọpọ awọn iṣẹku daadaa lori dada sperm.O yanilenu, alemo yii ni epitope antibody kan ti o ti han tẹlẹ lati dabaru pẹlu iṣẹ SPACA6 30.Ekun 3 gba mitari ati ẹgbẹ kan ti agbegbe Ig-like;agbegbe yii ni awọn prolines ti a fipamọ (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) ati pola ti nkọju si ode/awọn iṣẹku ti o gba agbara.Iyalenu, pupọ julọ awọn iṣẹku lori dada ti 4HB jẹ iyipada pupọ (Fig. 6b), botilẹjẹpe agbo ti wa ni ipamọ jakejado SPACA6 homologue (gẹgẹbi a ti tọka nipasẹ ilodisi ti mojuto budle hydrophobic) ati ni ikọja IST superfamily.
Botilẹjẹpe eyi jẹ agbegbe ti o kere julọ ni SPACA6 pẹlu awọn eroja igbekalẹ atẹle ti a rii diẹ, ọpọlọpọ awọn iyoku agbegbe hinge (pẹlu agbegbe 3) ni a tọju gaan laarin awọn homologues SPACA6, eyiti o le fihan pe iṣalaye ti lapapo helical ati β-sandwich ṣe ipa kan.bi Konsafetifu.Bibẹẹkọ, laibikita isunmọ hydrogen lọpọlọpọ ati awọn nẹtiwọọki elekitirotati ni agbegbe mitari ti SPACA6 ati IZUMO1, ẹri ti irọrun inu inu ni a le rii ni titete ti awọn ẹya ti a gba laaye pupọ ti IZUMO137,43,44.Iṣatunṣe ti awọn agbegbe kọọkan ni agbekọja daradara, ṣugbọn iṣalaye ti awọn agbegbe ti o ni ibatan si ara wọn yatọ lati 50 ° si 70 ° lati ipo aarin (Fig. S16).Lati ni oye awọn agbara imudani ti SPACA6 ni ojutu, awọn idanwo SAXS ni a ṣe (Fig. S17a,b).Ab initio atunkọ ti SPACA6 ectodomain conformed to a opa gara be (Fig. S18), biotilejepe Kratky Idite fihan diẹ ninu awọn ìyí ti ni irọrun (Fig. S17b).Ibaṣepọ yii ṣe iyatọ pẹlu IZUMO1, ninu eyiti amuaradagba ti ko ni asopọ dawọle apẹrẹ boomerang mejeeji ni lattice ati ni ojutu43.
Lati ṣe idanimọ agbegbe ti o rọ ni pato, hydrogen-deuterium exchange massspectroscopy (H-DXMS) ni a ṣe lori SPACA6 ati ni afiwe pẹlu data ti a gba tẹlẹ lori IZUMO143 (Fig. 7a,b).SPACA6 jẹ kedere ni irọrun diẹ sii ju IZUMO1, gẹgẹbi itọkasi nipasẹ paṣipaarọ deuterium ti o ga julọ jakejado eto lẹhin 100,000 s ti paṣipaarọ.Ninu awọn ẹya mejeeji, apakan C-terminal ti agbegbe mitari fihan ipele giga ti paṣipaarọ, eyiti o ṣee ṣe ngbanilaaye yiyi to lopin ti 4HB ati awọn ibugbe bii Ig ni ibatan si ara wọn.O yanilenu, apakan C-terminal ti SPACA6 hinge, ti o wa ninu 147CDLPLDCP154 iyokù, jẹ agbegbe 3 ti o ni aabo pupọ (Fig. 6b), o ṣee ṣe afihan pe irọrun interdomain jẹ ẹya ti o tọju itankalẹ ti SPACA6.Gẹgẹbi iṣiro irọrun, CD yo data yo ti gbona fihan pe SPACA6 (Tm = 51.2 ° C) ko ni iduroṣinṣin ju IZUMO1 (Tm = 62.9 ° C) (Fig. S1e ati S19).
a H-DXMS awọn aworan ti SPACA6 ati b IZUMO1.Paṣipaarọ deuterium ogorun ni ipinnu ni awọn aaye akoko ti a fihan.Awọn ipele ti paṣipaarọ hydrogen-deuterium jẹ itọkasi nipasẹ awọ lori iwọn gidienti lati buluu (10%) si pupa (90%).Awọn apoti dudu ṣe aṣoju awọn agbegbe ti paṣipaarọ giga.Awọn aala ti 4HB, mitari ati ašẹ Ig-bi ti a ṣe akiyesi ni ilana gara ni a fihan loke ilana akọkọ.Awọn ipele paṣipaarọ Deuterium ni 10 s, 1000 s, ati 100,000 s ni a gbìmọ lori aworan apẹrẹ kan ti o da lori awọn oju oju molikula ti SPACA6 ati IZUMO1.Awọn apakan ti awọn ẹya pẹlu ipele paṣipaarọ deuterium ni isalẹ 50% jẹ awọ funfun.Awọn agbegbe ti o wa loke 50% H-DXMS paṣipaarọ jẹ awọ ni iwọn iwọn-mimu.
Lilo CRISPR/Cas9 ati asin jiini knockout awọn ilana jiini ti yori si idanimọ ti ọpọlọpọ awọn ifosiwewe pataki fun sperm ati ẹyin abuda ati idapọ.Yato si ibaraenisepo ti o ni ihuwasi daradara ti IZUMO1-JUNO ati ẹya CD9, pupọ julọ awọn ọlọjẹ ti o ni nkan ṣe pẹlu idapọ gamete wa ni igbekalẹ ati iṣẹ ṣiṣe enigmatic.Isọdi biophysical ati igbekale ti SPACA6 jẹ nkan miiran ti adojuru molikula adhesion/fusion nigba idapọ.
SPACA6 ati awọn ọmọ ẹgbẹ miiran ti idile superfamily IST dabi ẹni ti a tọju gaan ni awọn ẹran-ọsin ati awọn ẹiyẹ kọọkan, awọn reptiles, ati awọn amphibians;ni otitọ, a ro pe SPACA6 paapaa nilo fun idapọ ni zebrafish 59. Pipin yii jẹ iru si awọn ọlọjẹ ti o ni ibatan gamete ti a mọ gẹgẹbi DCST134, DCST234, FIMP31, ati SOF132, ni imọran pe awọn okunfa wọnyi jẹ aipe HAP2 (bakannaa. ti a mọ si GCS1) awọn ọlọjẹ ti o ni iduro fun iṣẹ ṣiṣe kataliti ti ọpọlọpọ awọn protists., eweko, ati arthropods.Awọn ọlọjẹ idapọmọra idapọmọra 60, 61. Pelu ibajọra igbekalẹ ti o lagbara laarin SPACA6 ati IZUMO1, knockout ti awọn Jiini ti n yipada boya ninu awọn ọlọjẹ wọnyi yorisi infertility ninu awọn eku akọ, ti o nfihan pe awọn iṣẹ wọn ni idapo gamete ko ni pidánpidán..Ni fifẹ diẹ sii, ko si ọkan ninu awọn ọlọjẹ sperm ti a mọ ti o nilo fun ipele ifaramọ ti idapọ ti o jẹ apọju.
O jẹ ibeere ti o ṣii boya SPACA6 (ati awọn ọmọ ẹgbẹ miiran ti IST superfamily) kopa ninu awọn ipade intergametic, ṣe agbekalẹ awọn nẹtiwọọki intragametic lati gba awọn ọlọjẹ pataki si awọn aaye idapọ, tabi boya paapaa ṣe bi awọn fusogens ti o yege.Awọn iwadii ajẹsara-ajẹsara ninu awọn sẹẹli HEK293T ṣe afihan ibaraenisepo laarin ipari ipari IZUMO1 ati SPACA632.Sibẹsibẹ, awọn ectodomains recombinant ko ṣe ajọṣepọ ni vitro, ni iyanju pe awọn ibaraẹnisọrọ ti a rii ni Noda et al.Awọn mejeeji ti paarẹ ni ikole (ṣe akiyesi iru cytoplasmic ti IZUMO1, eyiti a fihan pe ko ṣe pataki fun idapọmọra62).Ni omiiran, IZUMO1 ati/tabi SPACA6 le nilo awọn agbegbe abuda kan pato ti a ko tun ṣe ni vitro, gẹgẹbi awọn imudara ti ẹkọ nipa ti ara tabi awọn eka molikula ti o ni awọn ọlọjẹ miiran (ti a mọ tabi ko tii ṣe awari).Botilẹjẹpe a gbagbọ IZUMO1 ectodomain lati ṣe agbero asomọ ti spermatozoa si ẹyin ni aaye perivitelline, idi ti SPACA6 ectodomain ko ṣe akiyesi.
Eto ti SPACA6 ṣe afihan ọpọlọpọ awọn ibi ipamọ ti o le ni ipa ninu awọn ibaraẹnisọrọ amuaradagba-amuaradagba.Apa ti a fipamọ ti agbegbe mitari lẹsẹkẹsẹ nitosi ero CXXC (apẹrẹ Patch 1 loke) ni ọpọlọpọ awọn iyoku oorun ti nkọju si ita ti o nigbagbogbo ni nkan ṣe pẹlu hydrophobic ati π-stacking awọn ibaraenisepo laarin awọn biomolecules.Awọn ẹgbẹ gbooro ti agbegbe Ig-like (agbegbe 2) ṣe apẹrẹ ti o ni idiyele ti o daadaa pẹlu Arg ti o ni aabo pupọ ati awọn iṣẹku Rẹ, ati pe awọn ọlọjẹ lodi si agbegbe yii ni iṣaaju ti lo lati dènà idapọ gamete 30.Apatakokoro mọ epitope laini 212RIRPAQLTHRGTFS225, eyiti o ni mẹta ninu awọn iṣẹku arginine mẹfa ati titọju His220 gaan.Ko ṣe kedere boya ailagbara naa jẹ nitori idinamọ ti awọn iṣẹku pato wọnyi tabi gbogbo agbegbe.Ipo ti aafo yii nitosi C-terminus ti β-sandwich tọkasi awọn ibaraẹnisọrọ cis pẹlu awọn ọlọjẹ sperm adugbo, ṣugbọn kii ṣe pẹlu awọn ọlọjẹ oocyte.Pẹlupẹlu, idaduro ti tangle proline-rich tangle (ojula 3) ti o ni irọrun ti o ni irọrun ti o wa laarin iṣipopada le jẹ aaye ti ibaraẹnisọrọ amuaradagba-amuaradagba tabi, diẹ sii, ṣe afihan idaduro ti irọrun laarin awọn ibugbe meji.Iwa jẹ pataki fun ipa aimọ ti SPACA6.idapọ ti awọn ere.
SPACA6 ni awọn ohun-ini ti awọn ọlọjẹ adhesion intercellular, pẹlu Ig-like β-sandwiches.Ọpọlọpọ awọn ọlọjẹ alemora (fun apẹẹrẹ, cadherins, integrins, adhesins, ati IZUMO1) ni ọkan tabi diẹ sii awọn ibugbe β-sandiwich ti o fa awọn ọlọjẹ lati awo sẹẹli si awọn ibi-afẹde ayika wọn63,64,65.Agbegbe Ig-like ti SPACA6 tun ni ero kan ti o wọpọ ti a rii ni β-sandwiches ti ifaramọ ati isomọ: awọn ilọpo meji ti awọn okun ti o jọra ni awọn opin ti β-sandwiches, ti a mọ si awọn clamps ẹrọ66.O gbagbọ pe idii yii mu ki resistance si awọn ipa irẹrun, eyiti o niyelori fun awọn ọlọjẹ ti o ni ipa ninu awọn ibaraẹnisọrọ intercellular.Sibẹsibẹ, pelu ibajọra yii si adhesins, Lọwọlọwọ ko si ẹri pe SPACA6 ṣe ajọṣepọ pẹlu awọn ẹyin funfun.SPACA6 ectodomain ko lagbara lati sopọ mọ JUNO, ati SPACA6 ti n ṣalaye awọn sẹẹli HEK293T, bi a ṣe han nibi, ko ni ibaramu pẹlu awọn oocytes ti ko ni zona 32.Ti SPACA6 ba ṣe agbekalẹ awọn ifunmọ intergametic, awọn ibaraenisepo wọnyi le nilo awọn iyipada lẹhin-itumọ tabi imuduro nipasẹ awọn ọlọjẹ sperm miiran.Ni atilẹyin ti igbero igbehin, IZUMO1-deficient spermatozoa sopọ si awọn oocytes, ti o ṣe afihan pe awọn ohun elo miiran ju IZUMO1 ni ipa ninu igbesẹ imudara gamete 27.
Ọpọlọpọ awọn ọlọjẹ, cellular, ati awọn ọlọjẹ idapọ idagbasoke ni awọn ohun-ini ti o ṣe asọtẹlẹ iṣẹ wọn bi awọn fusogens.Fun apẹẹrẹ, iṣọpọ gbogun ti glycoproteins (awọn kilasi I, II ati III) ni peptide idapọ hydrophobic tabi lupu ni opin amuaradagba ti a fi sii sinu awo agbalejo.Maapu hydrophilicity ti IZUMO143 ati eto (ti pinnu ati asọtẹlẹ) ti superfamily IST ko fihan peptide idapọ hydrophobic ti o han gbangba.Nitorinaa, ti eyikeyi awọn ọlọjẹ ninu idile superfamily IST ṣiṣẹ bi awọn fusogens, wọn ṣe bẹ ni ọna ti o yatọ si awọn apẹẹrẹ miiran ti a mọ.
Ni ipari, awọn iṣẹ ti awọn ọmọ ẹgbẹ ti idile superfamily IST ti awọn ọlọjẹ ti o ni nkan ṣe pẹlu idapọ gamete jẹ ohun ijinlẹ tantalizing.Molikula recombinant SPACA6 ti a ṣe afihan ati eto ipinnu rẹ yoo pese oye si awọn ibatan laarin awọn ẹya pinpin wọnyi ati ipa wọn ninu isọmọ gamete ati idapọ.
Ilana DNA ti o ni ibamu si SPACA6 ectodomain eniyan ti a ti sọtẹlẹ (nọmba wiwọle NCBI NP_001303901.1; awọn iyokù 27-246) jẹ iṣapeye codon fun ikosile ninu awọn sẹẹli Drosophila melanogaster S2 ati ti a ṣepọ bi ajẹkù jiini pẹlu ilana koodu Kosk (Eurofin Gezak)., ifihan agbara yomijade BiP ati 5 ′ ati 3’ ti o baamu fun cloning-ominira ligation ti jiini yii sinu fekito ikosile pMT ti o da lori olupolowo metallothionein ti a yipada fun yiyan pẹlu puromycin (pMT-puro).Awọn fekito pMT-puro ṣe koodu aaye thrombin kan ti o tẹle pẹlu ami ami C-terminal 10x-Re (Figure S2).
Iyipo iduroṣinṣin ti SPACA6 pMT-puro vector sinu awọn sẹẹli D. melanogaster S2 (Gibco) ni a ṣe bakanna si ilana ti a lo fun IZUMO1 ati JUNO43.Awọn sẹẹli S2 ti wa ni yo ati dagba ni alabọde Schneider (Gibco) ti o ni afikun pẹlu ifọkansi ikẹhin ti 10% (v / v) ooru-inactivated oyun serum (Gibco) ati 1X antimycotic aporo (Gibco).Awọn sẹẹli ipasẹ ni kutukutu (awọn sẹẹli 3.0 x 106) ni a palara ni awọn kanga kọọkan ti awọn awo daradara 6 (Corning).Lẹhin awọn wakati 24 ti abeabo ni 27 ° C, awọn sẹẹli ti yipada pẹlu adalu 2 miligiramu ti SPACA6 pMT-puro vector ati Effectene transfection reagent (Qiagen) ni ibamu si ilana ti olupese.Awọn sẹẹli ti a ti yipada ni a ti ṣabọ fun awọn wakati 72 ati lẹhinna ikore pẹlu 6 mg/ml puromycin.Lẹhinna a ya awọn sẹẹli kuro ni agbedemeji Schneider ti o pe ati gbe sinu omi ara Kokoro-XPRESS alabọde (Lonza) fun iṣelọpọ amuaradagba iwọn nla.Aṣa 1 L kan ti aṣa sẹẹli S2 ti dagba si awọn sẹẹli 8 – 10 × 106 milimita 1 ni 2 L ventilated alapin-bottomed polypropylene Erlenmeyer flask ati lẹhinna sterilized pẹlu ifọkansi ikẹhin ti 500 µM CuSO4 (Millipore Sigma) ati iyọdajẹ asan.ti a fa.Awọn aṣa ti o fa ti wa ni idawọle ni 27 ° C. ni 120 rpm fun ọjọ mẹrin.
Alabọde alabọde ti o ni SPACA6 ti ya sọtọ nipasẹ centrifugation ni 5660×g ni 4°C ti o tẹle pẹlu Centramate tangential sisan sisẹ eto (Pall Corp) pẹlu awo awọ 10 kDa MWCO kan.Waye alabọde ogidi ti o ni SPACA6 ninu si iwe 2 milimita Ni-NTA agarose resini (Qiagen).Resini Ni-NTA ni a fo pẹlu awọn iwọn iwe 10 (CV) ti ifipamọ A ati lẹhinna 1 CV ti ifipamọ A ni a fi kun lati fun ifọkansi imidazole ipari ti 50 mM.SPACA6 jẹ eluted pẹlu 10 milimita ti ifipamọ A ṣe afikun pẹlu imidazole si ifọkansi ikẹhin ti 500 mM.Ihamọ kilasi thrombin (Millipore Sigma) ni a fi kun taara si tubing dialysis (MWCO 12-14 kDa) ni 1 kuro fun mg SPACA6 vs. 1 L 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 ati 150 mM NaCl (buffer B) fun itọ-ọgbẹ.) ni 4 ° C fun wakati 48.SPACA6 ti thrombin-cleaved lẹhinna ti fomi ni ilọpo mẹta lati dinku ifọkansi iyọ ati ti kojọpọ lori 1 milimita MonoS 5/50 GL cation paṣipaarọ iwe (Cytiva/GE) ti o ni ibamu pẹlu 10 mM Tris-HCl, pH 7.5.A ti fọ oluyipada cation pẹlu 3 OK 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, lẹhinna SPACA6 ti yọkuro pẹlu itọsi laini lati 0 si 500 mm NaCl ni 10 mm Tris-HCl, pH 7.5 fun 25 O dara.Lẹhin chromatography paṣipaarọ ion, SPACA6 ti ni idojukọ si milimita 1 ati yọkuro isocratically lati inu iwe ENrich SEC650 10 x 300 (BioRad) ti o ni ibamu pẹlu buffer B. Gẹgẹbi chromatogram, adagun-odo ati awọn ipin ifọkansi ti o ni SPACA6.Iwa mimọ jẹ iṣakoso nipasẹ Electrophoresis ti o ni abawọn Coomassie lori 16% SDS-polyacrylamide gel.Ifojusi Amuaradagba jẹ iwọn nipasẹ gbigba ni 280 nm ni lilo ofin Beer-Lambert ati olusọdipúpọ iparun molar imọ-jinlẹ.
SPACA6 ti a sọ di mimọ jẹ titọpa ni alẹ kan lodi si 10 mM sodium fosifeti, pH 7.4 ati 150 mM NaF ati ti fomi si 0.16 mg/mL ṣaaju ṣiṣe itupalẹ nipasẹ CD spectroscopy.Ṣiṣayẹwo Spectral ti awọn CD pẹlu igbi ti 185 si 260 nm ni a gba lori Jasco J-1500 spectropolarimeter nipa lilo quartz cuvettes pẹlu 1 mm opitika ọna gigun (Helma) ni 25 ° C ni iwọn 50 nm/min.Sipekitira CD naa ni atunṣe ipilẹ ipilẹ, aropin ju awọn ohun-ini 10 lọ, ati iyipada si tumọ elliptical ti o ku (θMRE) ni awọn iwọn cm2/dmol:
nibiti MW jẹ iwuwo molikula ti ayẹwo kọọkan ni Da;N jẹ nọmba awọn amino acids;θ jẹ elliptical ni millidegrees;d ni ibamu si ipari ti ọna opopona ni cm;ifọkansi amuaradagba ni awọn iwọn.