ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Duplex Welded Tube Fun paati kemikali Kemikali Ile-iṣẹ Kemikali, aipe ti SPECC1L nyorisi iduroṣinṣin ti awọn isẹpo spliced ​​ati idinku idinku ti awọn sẹẹli crest ti ara cranial.

O ṣeun fun lilo si Nature.com.O nlo ẹya ẹrọ aṣawakiri kan pẹlu atilẹyin CSS lopin.Fun iriri ti o dara julọ, a ṣeduro pe ki o lo ẹrọ aṣawakiri imudojuiwọn kan (tabi mu Ipo Ibamu ṣiṣẹ ni Internet Explorer).Ni afikun, lati rii daju atilẹyin ti nlọ lọwọ, a fihan aaye naa laisi awọn aza ati JavaScript.

ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Duplex Weld Tube Fun Ile-iṣẹ Kemikali

Liaocheng Sihe SS Ohun elo Co., Ltd.jẹ olupilẹṣẹ asiwaju ti o jẹ amọja ni irin alagbara irin awọn ọpa oniho, awọn tubes annealed ti o ni imọlẹ, ọpọn ti o ni okun ti ko ni ailopin ati bẹbẹ lọ.Lati le dẹrọ awọn alabara, a ni awọn paipu welded ati awọn tubes paapaa.Liaocheng Sihe SS Ohun elo Co., Ltd.ni iṣelọpọ to ti ni ilọsiwaju julọ ati ohun elo idanwo.A le ni itẹlọrun ibeere rẹ patapata.Gẹgẹbi boṣewa ni muna, awọn tubes eyiti o ṣejade nipasẹ wa nigbagbogbo ni OD ati ifarada WT ti o pe.Iṣakoso ifarada jẹ muna ni ibamu lati gbejade awọn iṣedede.Awọn ọja wa ni itẹlọrun nigbagbogbo pẹlu awọn alabara.Awọn alabara ra awọn ọja wa ṣẹda awọn ere diẹ sii.
a) OD (Ode opin): 3.18mm to 101.6mm
b) WT (Sisanra odi): 0.5mm si 20mm
c) Ipari: Ni ibamu si ibeere alabara
d) Awọn ajohunše: ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 ati be be lo
e) Ọna ilana: ERW, EFW bbl

Sliders nfihan awọn nkan mẹta fun ifaworanhan.Lo awọn ẹhin ati awọn bọtini atẹle lati gbe nipasẹ awọn ifaworanhan, tabi awọn bọtini idari ifaworanhan ni ipari lati gbe nipasẹ ifaworanhan kọọkan.
Awọn sẹẹli crest neural cranial (CNCC) rọra kuro ni awọn agbo iṣan oyun ki o lọ si awọn arches pharyngeal, eyiti o jẹ pupọ julọ awọn ẹya aarin oju.Aṣiṣe CNCC ṣe ipa pataki ninu etiology ti orofacial cleft, aiṣedeede ti o wọpọ.Awọn iyipada Heterozygous SPECC1L ni a ti rii ni awọn alaisan ti o ni awọn clefts atypical ati syndromic.Nibi, a jabo imudara idoti ti awọn ohun elo isọdi alemora (AJ), β-catenin ati E-cadherin ninu awọn sẹẹli ikọlu SPECC1L ti aṣa, ati awọn micrographs elekitironi ṣe afihan itankale apical-basal ti AJ.Lati loye ipa ti SPECC1L ni craniofacial morphogenesis, a ṣẹda awoṣe asin aipe Specc1l kan.Awọn ẹda homozygous jẹ apaniyan ọmọ inu oyun ati ṣafihan tiipa ti tube nkankikan ti bajẹ ati lamination CNCC.Ajẹwọ amuaradagba AJ ti pọ si ni awọn agbo-ara ti iṣan.Aje AJ yii wa ni ibamu pẹlu abawọn kan ninu delamination CNCC, to nilo itusilẹ AJ.Ni afikun, awọn mutanti Specc11 ti dinku ami ifihan PI3K-AKT ati alekun apoptosis.Ni vitro, idinamọ kekere ti ifihan PI3K-AKT ninu awọn sẹẹli iru igbẹ ti to lati fa awọn ayipada AJ.Ni pataki, awọn iyipada AJ ti o fa nipasẹ SPECC1L knockdown le jẹ iyipada nipasẹ imuṣiṣẹ ti ọna PI3K-AKT.Papọ, awọn data wọnyi daba pe SPECC1L, gẹgẹbi olutọsọna aramada ti ami ifihan PI3K-AKT ati isedale AJ, ni a nilo fun pipade tube nkankikan ati isọdi CNCC.
Awọn sẹẹli crest neural cranial (CNCCs) ṣe agbegbe si neuroecoderm dorsal ati yọkuro kuro ninu neuroepithelium ti awọn agbo-ara ti o dagbasoke nipasẹ ilana ti o kan iyipada epithelial-mesenchymal (EMT) 1,2,3.Awọn CNCC epithelial ti iṣaju ti n ṣe idalọwọduro awọn isunmọ intercellular ati di awọn CNCC mesenchymal mesenchymal ti o kun awọn arches pharyngeal akọkọ ati keji ati dagba pupọ julọ ti kerekere craniofacial.Nitorinaa, awọn Jiini ti o ṣe ilana iṣẹ CNCC nigbagbogbo ni idalọwọduro ni etiology ti awọn anomalies congenital craniofacial gẹgẹbi awọn clefts orofacial, ti o wọpọ julọ ni ipa lori awọn ibimọ 1/800 ni AMẸRIKA nikan.Ọkan ninu awọn idibajẹ ti a bibi8.
Delamination ti CNCC ṣe deede pẹlu pipade tube iṣan iwaju laarin awọn ọjọ 8.5 ati 9.5 ti idagbasoke oyun ninu awọn eku.Awọn iyipada ti nọmba awọn jiini ti o ni ibatan cleft orofacial Asin tun ṣe afihan diẹ ninu iru abawọn tube neural, pẹlu Irf69,10, Ghrl310, Cfl111, ati Pdgfrα12.Bibẹẹkọ, awọn ilana ti pipade tube nkankikan ati isọdi CNCC ni a le gbero ni ominira, bi Asin mutant Splotch (Pax3) ṣe afihan awọn abawọn ni pipade tube nkankikan laisi ipa eyikeyi lori stratification CNCC tabi ijira 13,14.Awọn awoṣe asin afikun pẹlu awọn abawọn ni pipinka CNCC ati pipade tube nkankikan yoo ṣe iranlọwọ ṣe iyasọtọ ipilẹ molikula ti o wọpọ ti awọn ilana meji wọnyi.
Iyasọtọ ti CNCC lati awọn sẹẹli neuroepithelial nilo itusilẹ awọn isunmọ adhesive (AJs), eyiti o jẹ ti awọn eka amuaradagba ti o ni, laarin awọn miiran, E-cadherin, β-catenin, α-E-catenin, ati α-actinin ti o ni nkan ṣe pẹlu actin filaments 2 Awọn ijinlẹ overexpression E-cadherin ni awọn agbo-ara neural fihan idinku tabi idaduro ni delamination CNCC.Lọna miiran, idinku ti E-cadherin awọn abajade ni kutukutu stratification15,16.Ọpọlọpọ awọn okunfa ti o ṣe agbedemeji EMT lakoko isọdi CNCC jẹ awọn ifosiwewe transcription (AP2a, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) ati awọn ọlọjẹ ti n ṣatunṣe extracellular (ECM) gẹgẹbi awọn matrix metalloproteinases (MMPs), sibẹsibẹ awọn CNCC jẹ awọn olutọsọna cytoskeletal AJ taara. ko sibẹsibẹ mọ.Ọna PI3K-AKT ni a mọ lati tako awọn ipele E-cadherin, nipataki lati inu iwadii alakan17.Awọn ijinlẹ aipẹ ti fihan pe ipadanu ti ami ifihan PI3K-AKT ti o da lori PDGFa ninu awọn eku yori si awọn ohun ajeji craniofacial, pẹlu palate cleft ati awọn abawọn tube neural12.Sibẹsibẹ, ibatan laarin ọna PI3K-AKT ati iduroṣinṣin AJ lori stratification CNCC ko ṣe akiyesi.
A ti ṣe idanimọ SPECC1L tẹlẹ gẹgẹbi jiini mutant akọkọ ninu eniyan meji ti o ni cleft ti o lagbara ti o fa lati ẹnu si oju, ti a mọ ni oblique cleft (ObFC) tabi Tessier IV18 cleft.Awọn iyipada SPECC1L ni a ti ṣe idanimọ ni awọn idile multigenerational meji pẹlu iṣọn-alọ ọkan autosomal Opitz G/BBB (OMIM #145410), ninu eyiti awọn eniyan ti o kan fowo ṣe afihan hyperdistance ati cleft lip/palate19, ati ninu idile kan ti o ni Aisan apọju Tibi (OMIM #145420)20 .diẹ ẹ sii ju idaji awọn iṣẹlẹ ti Opitz G/BBB dídùn jẹ asopọ X (OMIM #300000) ati pe o ṣẹlẹ nipasẹ awọn iyipada ninu jiini MID1, eyiti o ṣe koodu amuaradagba 22 ti egungun sẹẹli ti o ni nkan ṣe pẹlu microtubule.A ṣe akiyesi pe SPECC1L, tun jẹ amuaradagba ti o ni nkan ṣe pẹlu microtubules ati actin cytoskeleton, le ṣe agbedemeji ifihan agbara ti o nilo fun atunṣe cytoskeleton actin nigba ifaramọ sẹẹli ati ijira 18.Nipasẹ in vitro ati awọn ikẹkọ vivo, a ṣe apejuwe SPECC1L bayi bi olutọsọna aramada ti iduroṣinṣin AJ nipasẹ ifihan PI3K-AKT.Ni ipele cellular, aipe SPECC1L yorisi idinku ninu ipele ti amuaradagba pan-AKT ati ilosoke ninu pipinka apical-basal ti AJ, eyiti a yọkuro nipasẹ imuṣiṣẹ kemikali ti ipa ọna AKT.Ni vivo, Specc11-aipe awọn ọmọ inu oyun ṣe afihan pipade tube nkankikan ti bajẹ ati idinku pipin CNCC.Nitorinaa, awọn iṣẹ SPECC1L ni isamisi ti o da lori ifaramọ sẹẹli ti ofin pupọ ti o nilo fun iṣẹ deede CNCC lakoko morphogenesis oju.
Lati ṣe apejuwe ipa ti SPECC1L ni ipele cellular, a lo aipe osteosarcoma cell laini U2OS ti a ti ṣalaye tẹlẹ ni SPECC1L18.Awọn sẹẹli U2OS iduroṣinṣin wọnyi pẹlu SPECC1L (kd) knockdown ni iwọntunwọnsi (60-70%) idinku ninu awọn ipele ti awọn iwe afọwọkọ SPECC1L ati awọn ọlọjẹ, pẹlu awọn abawọn ninu ijira ati atunto ti cytoskeleton actin 18. Ni idakeji, idinku igba diẹ pupọ ninu SPECC1L ti han lati ja si awọn abawọn mitotic 23.Lori isọdisi siwaju sii, a rii pe awọn sẹẹli SPECC1L-kd iduroṣinṣin wa yipada ẹda-ara ni iwọn giga ti confluence (Aworan 1).Awọn sẹẹli iṣakoso ẹnikọọkan ati awọn sẹẹli kd ni idapọ kekere dabi iru (Aworan 1A,D).Awọn wakati 24 lẹhin idapọ, awọn sẹẹli iṣakoso ni idaduro apẹrẹ cuboidal wọn (Fig. 1B, E), lakoko ti awọn sẹẹli SPECC1L-kd elongated (Fig. 1C, F).Iwọn iyipada yii ni apẹrẹ sẹẹli ni a mu nipasẹ aworan ifiwe laaye ti awọn sẹẹli iṣakoso ati awọn sẹẹli kd (fiimu 1).Lati pinnu ipa ti SPECC1L ninu awọn sẹẹli confluent, a kọkọ ṣe ayẹwo ikosile rẹ.A rii pe awọn ipele amuaradagba SPECC1L pọ si lori idapọ (Nọmba 1G), lakoko ti awọn ipele tiransikiripiti SPECC1L ko pọ si (Figure 1H).Ni afikun, bi iwuwo sẹẹli ti pọ si, amuaradagba SPECC1L ti a kojọpọ ni awọn aala intercellular (Fig. 2A-E), pẹlu apẹrẹ ti o ni agbekọja pẹlu ti β-catenin ti o ni ibatan awọ-ara (Fig. 2A'-E').Fi fun awọn ajọṣepọ ti SPECC1L pẹlu actin cytoskeleton 18,23 a pinnu pe SPECC1L ṣe ajọṣepọ pẹlu awọn isunmọ alemora ti o da lori actin (AJ).
(AF) SPECC1L knockdown (DF) ẹyin elongate ni ga confluence (F) akawe si Iṣakoso U2OS ẹyin (AC).Ti o han nibi ni awọn aaye mẹta ti awọn aaye akoko mẹfa (T1, T3, T6) ti a yan fun awọn iwuwo sẹẹli oriṣiriṣi.(G) Atupalẹ iwo-oorun ti n fihan pe amuaradagba SPECC1L ti wa ni iduroṣinṣin ni iwọn giga ti idapọmọra ni akawe si iwọn kekere ti confluence ninu awọn sẹẹli iṣakoso.Ibalẹ Oorun ti SPECC1L ṣe afihan iye 120 kDa ti o nireti ati iye iwuwo molikula ti o ga, o ṣee ṣe iyipada lẹhin-itumọ (*).Itupalẹ abawọn Western ti a ṣe labẹ awọn ipo kanna fun iwọn kekere ati giga.Awọn aworan ti o nfihan SPECC1L ni iwọn kekere ati giga ni a mu lati abawọn kanna.A yọ abawọn kanna kuro ati tun ṣe ayẹwo pẹlu aporo-ara β-actin.(H) Atunyẹwo RT-PCR pipo ṣe afihan ko si awọn ayipada pataki ni awọn ipele tiransikiripiti SPECC1L.Awọn ifi aṣiṣe ṣe aṣoju awọn SEM lati awọn adanwo ominira mẹrin.
(AE) A yan awọn aaye akoko mẹfa (T1-T6) ti o nsoju ọpọlọpọ awọn iwuwo sẹẹli lati ṣe deede itupalẹ apẹrẹ sẹẹli ati awọn iyipada AJ ninu awọn sẹẹli U2OS pẹlu SPECC1L knockdown (kd).Marun akọkọ ti awọn aaye akoko wọnyi pẹlu awọn sẹẹli kan ṣoṣo (T1), 50-70% idapọ ti awọn iṣupọ sẹẹli kekere (T2), idapọ laisi atunto awọn sẹẹli kd (T3), atunṣatunṣe awọn sẹẹli kd (T4), ati awọn ayipada wakati 24.ni irisi ẹhin ti awọn sẹẹli kd (T5).Amuaradagba SPECC1L ni pataki ti tuka ni cytoplasm ni T1 (A), ṣugbọn ikojọpọ rẹ ni a ṣe akiyesi ni awọn aala intercellular ni awọn aaye akoko atẹle (B–E, awọn ọfa).(FJ) β-catenin ṣe afihan ikojọpọ kanna ni awọn aala intercellular ti o ni nkan ṣe pẹlu eka AJ.(A'-E') SPECC1L ati β-catenin ṣe afihan abawọn agbekọja ni awọn aala sẹẹli ni iwuwo sẹẹli giga (awọn itọka).(F'-J') Ninu awọn sẹẹli SPECC1L-kd, abawọn β-catenin han ni deede ni iwuwo sẹẹli kekere (F'-H'), ṣugbọn gbooro bi apẹrẹ sẹẹli ṣe yipada (I', J'; awọn itọka), ti o nfihan pe AJ ti yipada.Ifi = 10 µm.
Lẹhinna a gbiyanju lati pinnu ipa ti aipe SPECC1L lori AJ.A lo ọpọlọpọ awọn asami ti o ni ibatan AJ, pẹlu awọn paati canonical F-actin, myosin IIb, β-catenin, ati E-cadherin24,25,26,27.Awọn okun aapọn Actin pọ si ni awọn sẹẹli SPECC1L-kd gẹgẹbi a ti ṣalaye tẹlẹ (Fig. 3A, B) 18.Myosin IIb ti o ni nkan ṣe pẹlu awọn filaments actin ṣe afihan iru ilosoke ninu awọn sẹẹli SPECC1L-kd ni vitro (Fig. 3C, D).β-catenin ti o ni nkan ṣe pẹlu AJ ti sopọ mọ cadherin ni awo sẹẹli, ti o nfihan ilana ikosile “oyin” deede ni awọn cubocytes iṣakoso (Fig. 3E,G).O yanilenu, ni awọn aworan alapin ti o nlo microscopy confocal, β-catenin (Fig. 3E,F) ati E-cadherin (Fig. 3G, H) ti o ni idoti lori awọ-ara sẹẹli ti awọn sẹẹli SPECC1L-deficient confluent ṣe afihan awọn ilana pataki ti abawọn ti o gbooro sii.Imugboroosi yii ti abawọn β-catenin ti o ni ibatan AJ ni awọn sẹẹli kd ni a sọ ni sisọpọ julọ, ṣugbọn o han lati ṣaju awọn ayipada ninu apẹrẹ sẹẹli (Fig. 2F-J, F'-J’).Lati pinnu iru ti ara ti idoti AJ ti o gbooro sii, a ṣe ayẹwo awọn aala sẹẹli lori apical-basal dada ti awọn sẹẹli SPECC1L-kd U2OS nipasẹ microscopy elekitironi gbigbe (TEM) (Figure 3I, J).Ni idakeji si awọn sẹẹli iṣakoso (Fig. 3I), eyiti o ni awọn agbegbe ipon elekitironi lọtọ ti itọkasi AJ (awọn itọka), awọn sẹẹli kd (Fig. 3J) ṣe afihan nla, awọn agbegbe ti o ni ibatan ti iwuwo elekitironi giga ti AJ pẹlu ọkọ ofurufu apicobasal..Ni afikun, lori awọn apakan ifapa, a ṣe akiyesi awọn agbo-ara sẹẹli ti o pọju ni awọn sẹẹli kd (Fig. S1A, B), eyiti o ṣe alaye ilana ti o gbooro sii ti β-catenin ati awọn ẹgbẹ idoti E-cadherin (Fig. 3F, H).Ni atilẹyin ti ipa ti SPECC1L ni AJs, β-catenin ni a ni idapọ-immunoprecipitated pẹlu SPECC1L ni awọn lysates ti awọn sẹẹli U2OS confluent (Fig. 3K).Pẹlú ajẹsara ajẹsara ti o gbooro fun awọn ami AJ, itupalẹ TEM ni ibamu pẹlu arosọ wa pe aipe SPECC1L ṣe alekun iwuwo apical-basal AJ ati iyatọ.
(AH) Alekun F-actin ni awọn sẹẹli kd ni awọn wakati 48 lẹhin-fusion (T6; A, B).Yipada abawọn myosin IIb ti o ni nkan ṣe pẹlu F-actin (C, D).Apẹrẹ didan ti β-catenin ati E-cadherin awo awọ-ara ni awọn sẹẹli iṣakoso (E, G) ti mu dara si ni awọn sẹẹli SPECC1L-kd (F, H).Ifi = 10 µm.(I-J) Awọn micrographs elekitironi ti n ṣakiyesi ikorita intercellular apical-basal.Awọn sẹẹli iṣakoso ṣafihan awọn agbegbe elekitironi ọtọtọ ti n tọka si awọn ọna asopọ alalepo (I, awọn ọfa).Ni idakeji, gbogbo apical-basal junction ni SPECC1L-kd ẹyin han elekitironi ipon (J, ọfà), afihan iwuwo pọ ati pipinka ti alemora ipade.(K) β-catenin jẹ ajẹsara-ajẹsara pẹlu SPECC1L ninu awọn lysates sẹẹli U2OS.Aworan ti o ya lati aaye kan ti o nsoju ọkan ninu awọn adanwo ominira mẹrin.
Lati loye ipa ti SPECC1L ni craniofacial morphogenesis, a ṣẹda awoṣe asin aipe Specc1l nipa lilo awọn laini sẹẹli ES trap ominira meji, DTM096 ati RRH048 (BayGenomics, CA), eyiti o jẹ aṣoju intron 1 ati awọn iwe afọwọkọ Specc1l ni a mu ni 15 (Fig. 1) .4A, eeya S2).Ipo genomic ti ifibọ vector decoy jẹ ipinnu nipasẹ gbogbo ilana genome ati timo nipasẹ PCR (Fig. S2).Awọn apẹrẹ ẹgẹ jiini mejeeji tun gba idapọ inu-fireemu ti awọn onirohin Specc11-lacZ lori imudani.Nitorinaa, ikosile lacZ ti a pinnu nipasẹ abawọn X-gal ni a lo bi itọkasi ti ikosile Specc11.Awọn alleles mejeeji ṣe afihan awọn ilana ikosile lacZ ti o jọra, pẹlu pakute jiini DTM096 ni intron 1 ti n ṣafihan ikosile ti o lagbara ju RRH048 ni intron 15 (ko han).Bibẹẹkọ, Specc1l ni a fihan ni gbogbogbo, pẹlu ikosile ti o lagbara ni pataki ninu awọn agbo iṣan ni E8.5 (Figure 4B), ninu tube neural ati awọn ilana oju ni E9.5 ati E10.5 (Figure 4C,D), ati ni awọn ọwọ ti ndagba. ni E10.5 ati oju (olusin 4D).A ṣe ijabọ tẹlẹ pe ikosile SPECC1L ni akọkọ pharyngeal arch ni E10.5 wa ninu epithelium ati mesenchyme18 ti o wa labẹ, ni ibamu pẹlu iran CNCC.Lati ṣe idanwo ikosile SPECC1L ni CNCC, a ṣe E8.5 neural folds (Figure 4E-J) ati E9.5 skull sections (Figure 4K-).Ni E8.5, SPECC1L abariwon nkankikan folda intensely (Fig. 4E, H), pẹlu awọn sẹẹli abariwon pẹlu NCC asami (Fig. 4G, J).Ni E9.5, SPECC1L (Fig. 4K, N) lagbara abariwon Iṣipo CNCC àjọ-abariwon pẹlu AP2A (Fig. 4L, M) tabi SOX10 (Fig. 4O, P).
(A) Aṣoju apẹrẹ ti jiini Specc11 Asin ti n ṣafihan ifibọ fekito decoy ni ES DTM096 (intron 1) ati RRH048 (intron 15) awọn ere ibeji sẹẹli.(BD) abawọn lacZ ti heterozygous Specc1lDTM096 awọn ọmọ inu oyun ti o nsoju ikosile Specc1l lati E8.5 si E10.5.NE = neuroectoderm, NF = agbo nkankikan, PA1 = arch pharyngeal akọkọ.(EP) SPECC1L ajẹsara pẹlu awọn asami NCC AP2A ati SOX10 ni E8.5 (NF; EJ) awọn agbo ti iṣan ati awọn apakan E9.5 (KP).Ibajẹ SPECC1L ni a ṣe akiyesi pupọ ni awọn agbo-ara E8.5 (E, H; awọn ori itọka), pẹlu awọn sẹẹli ti a samisi pẹlu AP2A (F, G; awọn ori itọka) ati SOX10 (I, J; awọn ori itọka).Ni E9.5, SPECC1L ni abariwọn ti o lagbara ti CNCCs ti nṣikiri (K, N; awọn ọfa) ti a samisi AP2A (L, M; awọn ọfa) ati SOX10 (O, P; awọn ọfa).
Líla laarin heterozygous Specc1lDTM096/+ ati awọn eku Specc1lRRH048/+ fihan pe awọn pakute jiini meji ko ni ibaramu ati pe awọn heterozygotes agbo-ara ati awọn homozygotes ọmọ inu oyun fun boya ẹgẹ trap allele jẹ apaniyan oyun (Table S1).Awọn ipin Mendelian ṣe afihan idinku ninu oṣuwọn iwalaaye ti heterozygotes ni ibimọ (ti a nireti 1.34 vs. 2.0).A ṣe akiyesi iku kekere perinatal laarin heterozygotes, diẹ ninu awọn ni awọn anomalies craniofacial (Fig. S3).Bibẹẹkọ, wiwu kekere ti awọn iru-ẹda craniofacial perinatal wọnyi jẹ ki o nira lati ṣe iwadi awọn ọna ṣiṣe pathophysiological abẹlẹ wọn.Nitorina, a dojukọ lori phenotype apaniyan oyun ti homozygous Specc11 mutanti.
Pupọ heterozygous yellow tabi homozygous Specc1lDTM096/RRH048 awọn ọmọ inu oyun ko ni idagbasoke lẹhin E9.5-10.5 (Figs. 5A-D), ati tube neural ko sunmọ iwaju (Figs. 5B, D) ati nigba miiran pipade lẹhin (ko han) ..Aṣiṣe pipade tube nkankikan cranial yii ni nkan ṣe pẹlu pupọ julọ ti CNCC ti samisi DLX2 ti o ku ninu awọn agbo nkankikan ni E10.5, ti n tọka pe ko si ipinya (Aworan 5A'-D').Lati pinnu boya iwọn gbogbogbo ti CNCC tun dinku, a samisi awọn laini CNCC pẹlu GFP ninu awọn laini ẹgẹ pupọ wa pẹlu Wnt1-Cre ati ROSAmTmG.A san lẹsẹsẹ GFP + NCC ati GFP- (RFP +) ti kii-NCC lati gbogbo oyun.Ni E9.5, ipin ti sisan-to-sisọ-titosi GFP-aami CNCC ko yipada ni pataki laarin WT ati awọn ọmọ inu oyun (ko han), ti n tọka sipesifikesonu CNCC deede.Nitoribẹẹ, a pinnu pe Wnt1-Cre ti o ku ati abawọn DLX2 ni awọn folda ti iṣan ti o han (Figure 5B') jẹ nitori abawọn CNCC Layering, o ṣee ṣe nitori iwuwo ti o pọ si tabi pipinka ti awọn sẹẹli AJ, bi a ti rii ninu awọn sẹẹli SPECC1L-kd.A lo awọn asami NCC SOX10, AP2A, ati DLX2 lati jẹrisi wiwa CNCC ninu agbo iṣan (Nọmba 5E-R).Ni E8.5, aibikita agbo neural fun gbogbo awọn ami NCC mẹta ni a ṣe akiyesi ni awọn apakan ti WT (Fig. 5E, G, I) ati Specc1l mutant (Fig. 5F, H, J).Ni E9.5, lakoko ti awọn ami NCC ti nṣipo NCC ni awọn apakan WT (Fig. 5M, O, Q), abawọn NCC ti o ku ni a ṣe akiyesi ni awọn agbo-ara ti o han ti Specc1l mutant embryos (Fig. 5N, P, R).Nitori SOX10 ati DLX2 samisi awọn CNCC iṣikiri, abajade yii ni imọran pe SPECC1L-aini CNCC ṣaṣeyọri sipesifikesonu-iṣiwa-lẹhin ṣugbọn kuna lati jade kuro ni awọn agbo-ara.
Aipe Specc11 yori si pipade tube nkankikan ti o ni abawọn, delamination ti awọn sẹẹli crest ti cranial ati awọn AJs.
(A, B') E9.5 WT (A) Ọmọ inu oyun ti n gbe awọn sẹẹli crest ti cranial cranial (CNCC) ti a samisi pẹlu Wnt1-Cre (A').Ni idakeji, Specc11 mutanti awọn ọmọ inu oyun ṣe afihan awọn folda ti iṣan ti o ṣii (B), awọn ori itọka) ati awọn CNCC ti ko tii lọ (B', awọn ori itọka).(C, D') Awọn aworan aaye imọlẹ (C, D') ati ajẹsara (C', D') ti ami CNCC DLX2 ti E10.5 WT awọn ọmọ inu oyun (C, C') ati Specc1l (D, D').Ninu awọn ọmọ inu WT E10.5, DLX2-rere CNCC ṣe akoso awọn arches gill (C', awọn ọfà), lakoko ti o wa ninu awọn mutanti, abawọn ti o han gbangba wa ni awọn agbo-ara ti o ṣii (D', awọn itọka) ati ni awọn arches pharyngeal akọkọ (D', ọfà).) pẹlu diẹ ninu awọn abawọn (awọn itọka) ti o nfihan delamination ti ko dara ati ijira ti CNCC.ER) Awọn apakan ti WT ati awọn ọmọ inu oyun ti Specc1l ni awọn ipele E8.5 (E-L) ati E9.5 (M–R) ni aami pẹlu awọn ami NCC SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, O, P) ati DLX2 (I, J, Q, R).Ni E8.5, abawọn NCC ni a ṣe akiyesi ni agbo-ara-ara-ara ti egan (NF) ati awọn apakan mutant.Apapo-abariwon ti SOX10 ati β-catenin ni E8.5 WT (K) ati mutant (L) ṣafihan abawọn β-catenin ti o pọ si ni awọn aala sẹẹli ni awọn agbo-ara.Ni E9.5, aibikita iru egan ti CNCCs ti njade (M, O, Q) ni a ṣe akiyesi, lakoko ti o wa ninu awọn mutanti, awọn CNCC ti ko ni iyasọtọ ti ni abariwọn awọn folda ti iṣan ti o ṣii (N, P, R).(S–Z) Iwadi isamisi vivo AJ ni awọn apakan coronal ti WT ati Specc11DTM096/RRH048 oyun pẹlu iyipada E9.5.Ofurufu abala isunmọ kan han ni igun apa ọtun oke.Ni awọn apakan ti awọn sẹẹli mutant, abawọn ti o pọ si ti F-actin (S, T) ati myosin IIb (U, V) ni a ṣe akiyesi.Gegebi awọn abajade in vitro ni aworan 3, ninu awọn ọmọ inu oyun, imudara awopọ awopọ fun β-catenin (W, X) ati E-cadherin (Y, Z) ni a ṣe akiyesi.(AA-BB) Micrograph elekitironi ti apakan kan ti oyun-iru-ẹgan ti n wo ikọja aala sẹẹli apical-basal ṣe afihan agbegbe ipon elekitironi ọtọtọ ti itọkasi awọn isunmọ alemora (AA, awọn ọfa).Ni idakeji, ni awọn apakan ti Specc11 mutant embryos (BB, ọfà), gbogbo ipade apicobasal jẹ ipon elekitironi, ti o nfihan iwuwo ti o pọ si ati pipinka ti awọn ipade alemora.
Lati ṣe idanwo idawọle wa pe idinku Layer jẹ nitori AJ ti o yipada, a ṣe ayẹwo aami AJ ni awọn agbo-ara ti o han ti Specc1l mutant oyun (Fig. 5S-Z).A ṣe akiyesi ilosoke ninu awọn okun aapọn actin (Fig. 5S, T) ati isọdọkan pọ si agbegbe ti myosin IIB idoti lori awọn okun actin (Fig. 5U, V).Ni pataki, a ṣe akiyesi abawọn ti o pọ si ti β-catenin (Fig. 5W, X) ati E-cadherin (Fig. 5Y, Z) ni awọn aala intercellular.A tun ṣe ayẹwo abawọn β-catenin ti NCC ninu awọn agbo-ara ti E8.5 awọn ọmọ inu oyun (Fig. 5K, L).β-catenin idoti han lati ni okun sii ni Specc1l mutant neural folds (Fig. 5L ati K), ni iyanju pe awọn iyipada AJ ti bẹrẹ.Ninu awọn micrographs elekitironi ti awọn abala timole ti awọn ọmọ inu oyun E9.5, a tun ṣe akiyesi abawọn elekitironi-ipon ti o tan kaakiri ni awọn ọmọ inu oyun mutant Specc1l ni akawe si WT (Fig. 5AA, BB ati S1E-H).Papọ, awọn abajade wọnyi ṣe atilẹyin awọn abajade in vitro wa ninu awọn sẹẹli SPECC1L-kd U2OS ati daba pe abawọn AJ aberrant ṣaju stratification CNCC ninu awọn ọmọ inu oyun wa.
Fi fun ibatan atagonistic ti a mọ laarin iṣẹ AKT ati iduroṣinṣin E-cadherin, 17,28 a ṣe ipinnu ilowosi ti ifihan PI3K-AKT.Ni afikun, a ṣe akiyesi roro subepidermal ni diẹ ninu awọn ọmọ inu oyun wa ti o salọ apaniyan (<5%) ni E9.5-10.5 ati dipo gbe ni ayika E13.5 (Fig. S3).Awọn vesicles Subepidermal jẹ ami-ami ti ifihan PI3K-AKT ti o dinku ti o da lori PDGFRα12.Fantauzzo et al.(2014) royin pe idalọwọduro ti imuṣiṣẹ PI3K ti o da lori PDGFRa ni PdgfraPI3K/PI3K awọn ọmọ inu inu oyun inu awọn iyọrisi subepidermal, awọn abawọn tube nkankikan, ati awọn apanirun palate phenotypes.Nitootọ, awọn ipele ti pan-AKT ati phosphorylated Ser473-AKT ti nṣiṣe lọwọ ti dinku ni vivo ni Specc1l mutant tissues si idaduro oyun E9.5 (Fig. 6A-D).Idinku ninu awọn ipele ti phosphorylated Ser473-AKT le jẹ patapata nitori idinku ninu awọn ipele ti pan-AKT ni vivo (FIG. 6E) ati in vitro (FIG. 6F).Idinku in vitro ni a ṣakiyesi nikan nigbati awọn sẹẹli U2OS ni idapo ni agbara pẹlu awọn ayipada ninu apẹrẹ sẹẹli ati iwuwo AJ (Aworan 6D).Nitorinaa, data wa daba pe SPECC1L jẹ olutọsọna rere aramada ti ifihan PI3K-AKT ni morphogenesis craniofacial.
(A-E) E8.5 (A, B) ati E9.5 (C, D) awọn abala timole tabi E9.5 lysates lati Specc1l mutant oyun (E) ti o nfihan awọn ipele ti phosphorylated ti nṣiṣe lọwọ S473-AKT ati pan-AKT Protein idinku , akawe si iṣakoso WT.Western blotting ti a ṣe lori egan-Iru lysates ati mutant lysates labẹ awọn ipo kanna.Awọn aworan ti o han fun SPECC1L ni a ya lati abawọn kan.A yọ abawọn kanna kuro ati tun ṣe ayẹwo pẹlu egboogi-pan-ACT ati awọn aporo-ara β-actin.Awọn ipele Pan-AKT ni E8.5 neural folds (A, B) ati awọn ipele ti phosphorylated S473-AKT ni awọn apakan E9.5 timole ti dinku ni pataki.(F) Awọn ipele Pan-AKT ni a dinku bakanna ni awọn lysates ti awọn sẹẹli SPECC1L-kd U2OS ti a kojọpọ ni ilopọ giga.Awọn ifi aṣiṣe ṣe aṣoju awọn SEM lati awọn iwọn ijẹẹnuwọn ominira mẹta ti Oorun.(GJ) Awọn apakan ti awọn ọmọ inu inu WT ni E9.5 ti o ni abawọn pẹlu KI67 ati caspase 3 ti a pin, ni atele, ti o nfihan ilọsiwaju sẹẹli (G, G') ati iṣẹ-ṣiṣe apoptotic kekere (H, H').Specc11 mutant oyun ṣe afihan isọdi sẹẹli ti o jọra (I), ṣugbọn nọmba awọn sẹẹli ti o ngba apoptosis ti pọ si ni pataki (J).
Lẹhinna a ṣe ayẹwo awọn aami ifasilẹ ati apoptosis.A ko ṣe akiyesi iyatọ eyikeyi ninu ilọsiwaju ti awọn ọmọ inu oyun E9.5 (Fig. 6E, G ni akawe si I) pẹlu itọka afikun ti 82.5% fun awọn mutanti WT ati 86.5% fun Specc1l mutants ti a ṣewọn nipasẹ KI67 idoti (p <0.56, Fisher's idanwo gangan).Bakanna, a ko ṣe akiyesi iyatọ eyikeyi ninu apoptosis ti a ṣewọn nipasẹ abawọn fun caspase 3 ti a pin ni awọn agbo-ara ni E8.5 titi di igba ti oyun inu oyun (ko han) (ko han).Ni idakeji, apoptosis ti pọ si ni pataki ni gbogbo awọn ọmọ inu oyun E9.5 (Fig. 6F, H ati J).Ilọsiwaju gbogbogbo yii ni apoptosis wa ni ibamu pẹlu isamisi PI3K-AKT ti o dinku ati iku iku ọmọ inu oyun29,30,31.
Nigbamii, lati jẹrisi ipa idi kan fun ami ifihan PI3K-AKT ni awọn ayipada AJ ninu awọn sẹẹli kd wa, a ṣe iyipada kemikali ipa ọna ni iṣakoso ati awọn sẹẹli kd (Nọmba 7A-F).A lo bi ami ami apẹrẹ sẹẹli iyipada phenotype ti a ṣe akiyesi ni awọn sẹẹli SPECC1L-kd confluent, eyiti a ṣe iwọn ni lilo ipin ti iwọn gigun julọ (ipari) si iwọn inaro ti o baamu (iwọn).Ipin kan ti 1 ni a nireti fun yika tabi awọn sẹẹli kuboidal (Aworan 7G).Ni afikun si apẹrẹ sẹẹli, a tun jẹrisi ipa lori AJ nipasẹ abawọn β-catenin (Fig. 7A'-F').Idinamọ ọna PI3K-AKT nipa lilo wortmannin ti to lati yi apẹrẹ sẹẹli pada ninu awọn sẹẹli iṣakoso (Figure 7A,C) ati AJ (Figure 7A').PI3K-AKT activator SC-79 ko ni ipa lori apẹrẹ sẹẹli (FIG. 7A, E) tabi AJ imugboroosi (FIG. 7A') ninu awọn sẹẹli iṣakoso.Ninu awọn sẹẹli SPECC1L-kd, titẹ siwaju sii ti ọna PI3K-AKT yorisi apoptosis ti o pọ si (Fig. 7B,D) ati ilosoke ti o samisi ni abawọn β-catenin (Fig. 7B'), ni ibamu pẹlu awọn mutanti wuwo ni vivo.Ni pataki, imuṣiṣẹ ti ọna PI3K-AKT ni ilọsiwaju apẹrẹ sẹẹli ni pataki (Aworan 7B,F) ati AJ phenotypes (Figure 7B”).Awọn iyipada ninu apẹrẹ sẹẹli jẹ iwọn bi ipin iyipo sẹẹli (CCR) ati ni afiwe fun pataki bi a ti ṣalaye loke (FIG. 7G).Nitootọ, ninu awọn sẹẹli iṣakoso (Fig. 7G, CCR = 1.56), itọju wortmannin ti to lati ṣe iyipada apẹrẹ sẹẹli (Fig. 7G, CCR = 3.61, p <2.4 × 10-9) si iye ti o jọra si eyi ti a ṣe akiyesi. ninu SPECC1L.-kd ẹyin (olusin 7G, CCR = 3,46).Itọju Wortmannin ti awọn sẹẹli SPECC1L-kd (Fig. 7G, CCR = 3.60, aifiyesi) ko ṣe pataki ju awọn sẹẹli kd ti ko ni itọju (Fig. 7G, CCR = 3.46, aifiyesi) tabi awọn sẹẹli iṣakoso wortmannin (Fig. 7G)., CCR = 3.46, aifiyesi) ni afikun yoo ni ipa lori elongation sẹẹli (7G, CCR = 3.61, aifiyesi).Pataki julo, SC-79 AKT activator ṣe atunṣe phenotype elongated ti awọn sẹẹli SPECC1L-kd (Fig. 7G, CCR = 1.74, p <6.2 × 10-12).Awọn abajade wọnyi jẹri pe SPECC1L ṣe ilana ifihan PI3K-AKT ati daba pe idinku iwọntunwọnsi ni SPECC1L yoo ni ipa lori ifaramọ sẹẹli, lakoko ti idinku to lagbara yoo yori si apoptosis (Fig. 8).
(A-F') Iṣakoso (A, C, E) ati SPECC1L-kd (B, D, F) awọn sẹẹli ti a tọju pẹlu PI3K-AKT inhibitor wortmannin (C, D) tabi SC-79 activator (E, F) Itọju Awọn sẹẹli iṣakoso ti ko ni itọju jẹ cuboidal (A) pẹlu abawọn cellular β-cat deede (A'), lakoko ti awọn sẹẹli kd ti wa ni elongated (B) pẹlu β-cat ti o pọ si (B').Lẹhin titẹkuro ti ọna PI3K-AKT, awọn sẹẹli iṣakoso elongated (C) pẹlu imugboroja β-nran (C'), lakoko ti awọn sẹẹli kd bẹrẹ lati faragba apoptosis (D), ti o jọra si awọn ọmọ inu oyun wa ti o ni iyipada pupọ ati ṣafihan β-cat ti mu dara si.idotin (D').Lẹhin imuṣiṣẹ ti ọna PI3K-AKT, awọn sẹẹli iṣakoso wa kuboidal (E) ati pe wọn ni abawọn β-cat (E') deede, lakoko ti awọn sẹẹli kd ṣe afihan apẹrẹ sẹẹli ti o ni ilọsiwaju pupọ (F) ati β-cat (F’), ti n tọka si. (G) Iwọn iyipada apẹrẹ sẹẹli ni (AF) jẹ iwọn nipa lilo ipin iyipo sẹẹli (CCR) ti iwọn gigun julọ (ipari) ati iwọn inaro ti o baamu (iwọn) nipa lilo sọfitiwia MetaMorph.Awọn sẹẹli ti ko ni itọju (NT) SPECC1L-kd (CCR = 3.46) ti gun ju awọn sẹẹli iṣakoso lọ (CCR = 1.56, p <6.1 × 10-13).Idinamọ Wort ti ọna PI3K-AKT ni awọn sẹẹli iṣakoso ti to lati fa iru elongation kan ni apẹrẹ sẹẹli (CCR=3.61, p<2.4×10-9).Bakanna, imuṣiṣẹ AKT nipasẹ SC-79 ni awọn sẹẹli SPECC1L-kd ṣe atunṣe elongation sẹẹli si awọn ipele iṣakoso (CCR = 1.74, p <6.2 × 10-12).Itọju Wortmannin ti awọn sẹẹli SPECC1L-kd yorisi apoptosis ti o pọ si ṣugbọn ko si ilọsiwaju siwaju ninu iyipada apẹrẹ sẹẹli (CCR = 3.60) ni akawe si kd ti ko ni itọju (CCR = 3.46, ns) tabi awọn sẹẹli iṣakoso wortmannin (3.61) ti a ṣe akiyesi ni.ns = ko ṣe pataki.+/- Awọn wiwọn SEM fun awọn sẹẹli 50 ni a fihan.Awọn iyatọ ti iṣiro jẹ iṣiro nipa lilo t-idanwo Ọmọ ile-iwe.
(A) Aṣoju sikematiki ti idinamọ ati ṣiṣiṣẹ ti ọna PI3K-AKT ti o yorisi awọn iyipada AJ ati igbala, lẹsẹsẹ.(B) Awoṣe ti a dabaa fun imuduro amuaradagba AKT nipasẹ SPECC1L.
Awọn CNCC ti iṣaju nilo lysis AJ lati yapa kuro ninu agbo iṣan neuroepithelial iwaju1,15,32.Alekun idoti ti awọn paati AJ ati isonu ti apical-basal AJ asymmetric pinpin ni SPECC1L-aipe awọn sẹẹli mejeeji ni vitro ati ni vivo, ni idapo pẹlu isunmọ ti ara ti SPECC1L si β-catenin, daba pe awọn iṣẹ SPECC1L lati ṣetọju iduroṣinṣin agbegbe AJ daradara fun iṣan agbari.cytoskeleton actin.Ijọpọ ti SPECC1L pẹlu cytoskeleton actin ati β-catenin ati ilosoke ninu nọmba awọn filamenti actin ti a fipa ni laisi SPECC1L ni ibamu pẹlu ilosoke ti a ṣe akiyesi ni iwuwo AJ.O ṣeeṣe miiran ni pe nọmba ti o pọ si ti awọn okun actin ninu awọn sẹẹli aipe SPECC1L nyorisi iyipada ninu ẹdọfu intercellular.Nitori aapọn cellular yoo ni ipa lori awọn agbara AJ 33, awọn iyipada foliteji le ja si ni tan kaakiri AJ 34 diẹ sii.Nitorinaa eyikeyi awọn ayipada yoo ni ipa lori awọn ipele CNCC.
Wnt1 jẹ afihan ni awọn ipapọ iṣan ara ni kutukutu ti o funni ni awọn sẹẹli crest nkankikan.Nitorinaa, wiwa ila ila Wnt1-cre jẹ ami ami-ṣaaju ati gbigbe NCC35.Bibẹẹkọ, Wnt1 tun ṣe samisi awọn ere ibeji ti iṣan ọpọlọ dorsal tun yo lati awọn ipapọ iṣan ara ni kutukutu 35,36, ti o jẹ ki o ṣee ṣe pe abawọn wa ti awọn mutanti E9.5 fun awọn asami Wnt1 ni awọn folda ti iṣan ṣiṣi kii ṣe CNCC.Abawọn rere wa fun awọn asami NCC AP2A ati SOX10 jẹrisi pe awọn agbo-ara ti o han ti awọn ọmọ inu oyun mutant Specc11 ni CNCC nitootọ.Ni afikun, niwọn bi AP2A ati SOX10 jẹ awọn ami-ami ti NCC iṣiwa ni kutukutu, abawọn rere fihan pe awọn sẹẹli wọnyi jẹ CNCC ti iṣikiri lẹhin-iṣikiri ti ko le ṣe iyasọtọ nipasẹ E9.5.
Awọn data wa daba pe ilana molikula ti AJ nipasẹ SPECC1L jẹ ilaja nipasẹ ami ifihan PI3K-AKT.Ifihan AKT ti dinku ni awọn sẹẹli aipe SPECC1L ati awọn ara.Awọn awari nipasẹ Fantauzzo et al.ṣe atilẹyin ipa taara fun ami ifihan PI3K-AKT ni morphogenesis craniofacial.(2014) fihan pe aini imuṣiṣẹ ti PDGFRa-orisun PI3K-AKT ifihan agbara nyorisi si phenotype palate cleft.A tun fihan pe idinamọ ọna PI3K-AKT ti to lati yi AJ ati apẹrẹ sẹẹli pada ninu awọn sẹẹli U2OS.Ni ibamu pẹlu awọn awari wa, Kain et al.37 fihan pe isọdọtun ti PI3K α110 subunit ni awọn sẹẹli endothelial ni abajade iru ilosoke ninu abawọn pericellular β-catenin, ti a tọka si bi ilosoke ninu “itọka Asopọmọra”.Bibẹẹkọ, ninu awọn sẹẹli endothelial ti awọn filaments actin ti ṣeto tẹlẹ gaan, titẹkuro ti ipa ọna PI3K-AKT ni awọn abajade sẹẹli alaimuṣinṣin.Ni idakeji, awọn sẹẹli SPECC1L-kd U2OS ṣe afihan apẹrẹ sẹẹli elongated.Iyatọ yii le jẹ pato iru sẹẹli.Lakoko ti titẹkuro ti ami ifihan PI3K-AKT ni ipa lori cytoskeleton actin patapata, ipa lori apẹrẹ sẹẹli jẹ ipinnu nipasẹ awọn ayipada ninu ẹdọfu ti o fa nipasẹ awọn iyipada ninu iwuwo ati iṣeto ti awọn okun actin aarin.Ninu awọn sẹẹli U2OS, a lo awọn iyipada apẹrẹ sẹẹli nikan bi ami ami SPECC1L-aipe AJ iyipada ati imularada.Ni ipari, a ṣe akiyesi pe idinamọ ti ọna AKT ni aipe SPECC1L mu iduroṣinṣin AJ ati dinku delamination ni CNCC.
O yanilenu, awọn ipele pan-AKT ti dinku ni vitro ati ni vivo ni afikun si awọn ipele 473-AKT phosphorylated ni laisi SPECC1L, ni iyanju ilana ti PI3K-AKT ifihan agbara ni ipele ti iduroṣinṣin amuaradagba AKT tabi iyipada.Awọn Jiini SPECC1L ati MID1, mejeeji ti o ni nkan ṣe pẹlu iṣọn Opitz/GBBB, ṣe koodu awọn ọlọjẹ ti o ṣe iduroṣinṣin microtubules 18,22.Ilana nipasẹ eyiti SPECC1L ati MID1 mediate microtubule imuduro ko ni oye ni kikun.Ninu ọran ti SPECC1L, imuduro yii pẹlu imudara acetylation ti ipin kan ti microtubules 18.O ṣee ṣe pe SPECC1L lo ilana ti o jọra lati ṣe iduroṣinṣin awọn ọlọjẹ miiran bii AKT.O ti ṣe afihan pe acetylation ti awọn iṣẹku lysine ninu amuaradagba AKT yori si idinku ninu isọdi membran ati phosphorylation38.Ni afikun, ibigbogbo ti pq K63 ni aloku lysine kanna lori AKT ni a nilo fun isọdi agbegbe ati imuṣiṣẹ39,40.Lara awọn ifosiwewe pupọ ti o n ṣepọ pẹlu awọn ọlọjẹ SPECC1L ti a damọ ni ọpọlọpọ awọn iwukara iwukara giga ti awọn iboju arabara meji, mẹrin - CCDC841, ECM2942, APC ati UBE2I43 - ti ni ipa ninu iyipada amuaradagba tabi iduroṣinṣin nipasẹ ibigbogbo tabi sumoylation.SPECC1L le ni ipa ninu iyipada lẹhin-itumọ ti awọn iṣẹku AKT lysine, ti o ni ipa lori iduroṣinṣin AKT.Bibẹẹkọ, ipa pataki ti SPECC1L ni isọdibilẹ ati iduroṣinṣin ti amuaradagba AKT wa lati ṣe alaye.
Awọn abawọn to buruju ninu ikosile SPECC1L ni vivo yorisi ni alekun ami ami AJ ati apọju CNCC aibuku, bakanna bi apoptosis ti o pọ si ati apaniyan ọmọ inu oyun ni kutukutu.Awọn ijabọ iṣaaju ti fihan pe awọn asin asin pẹlu awọn ipele ti o pọ si ti apoptosis ni nkan ṣe pẹlu awọn abawọn tube neural 44,45,46,47 ati awọn abawọn craniofacial48.O ti daba pe iku sẹẹli ti o pọ julọ ninu awọn agbo-ara tabi awọn arches pharyngeal le ja si nọmba ti ko pe ti awọn sẹẹli ti o nilo fun gbigbe morphogenetic to dara 48,49,50.Ni idakeji, awọn laini sẹẹli SPECC1L aipe wa pẹlu ikosile SPECC1L ti o dinku niwọntunwọnsi fihan awọn iyipada AJ nikan laisi ẹri ti iku sẹẹli ti o pọ si.Sibẹsibẹ, idinamọ kemikali ti ọna PI3K-AKT ninu awọn sẹẹli Kd wọnyi ṣe abajade apoptosis ti o pọ si.Nitorinaa, idinku iwọntunwọnsi ni ikosile tabi iṣẹ SPECC1L ṣe idaniloju iwalaaye sẹẹli.Eyi ni ibamu pẹlu akiyesi pe awọn ọmọ inu oyun ti o ṣọwọn Specc11 ti o salọ imuni ni St.E9.5-boya nitori idinku ṣiṣe imudani jiini-ni anfani lati pa awọn tubes ti ara wọn duro ati duro nigbamii ni idagbasoke, nigbagbogbo pẹlu awọn abawọn craniofacial (Fig. S3).Paapaa ni ibamu pẹlu eyi ni iṣẹlẹ toje ti awọn ọmọ inu oyun heterozygous Specc1l pẹlu awọn aiṣedeede craniofacial — boya nitori imudara imudara jiini ti o pọ si — bakanna bi wiwa ninu zebrafish ninu eyiti ọkan ninu awọn orthologues SPECC1L meji (specc1lb) fa awọn iṣẹlẹ ti oyun oyun ti pẹ, pẹlu pipadanu awọn phenotypes oyun. ẹrẹ̀ ìsàlẹ̀ àti ségesège ẹgbẹ́ méjì51.Nitorinaa, heterozygous SPECC1L awọn iyipada ipadanu iṣẹ-ṣiṣe ti a mọ ni awọn alaisan eniyan le fa awọn ailagbara kekere ni iṣẹ SPECC1L lakoko morphogenesis craniofacial, ti o to lati ṣalaye awọn clefts orofacial wọn.Ilana ti o da lori SPECC1L ti awọn olubasọrọ intercellular le tun ṣe ipa ninu palatogenesis ati idapọ ti awọn arches pharyngeal.Awọn ijinlẹ siwaju sii ti iṣẹ SPECC1L yoo ṣe iranlọwọ lati ṣalaye ipa ti awọn olubasọrọ intercellular fun igba diẹ ni CNCC lakoko pipade tube neural ni motility cell neuroepithelial ati morphogenesis craniofacial.
U2OS osteosarcoma iṣakoso ati awọn sẹẹli SPECC1L-kd ti ṣe apejuwe tẹlẹ (Saadi et al., 2011).Awọn ajẹsara lodi si SPECC1L tun ti ṣe afihan tẹlẹ (Saadi et al., 2011).Anti-β-catenin aporo (ehoro; 1:1000; Santa Cruz, Dallas, TX) (eku; 1: 1000; Imọ-ẹrọ Itọka sẹẹli, Danvers, MA), myosin IIb (1:1000; Sigma-Aldrich, St. Louis ) , MO) ), E-cadherin (1:1000; Abkam, Cambridge, MA), AP2A (1:1000; Novus Biologicals, Littleton, Colo.), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, San Diego , California), DLX2 (1: 1000; Abcam, Cambridge, MA), phospho-Ser473-AKT (1: 1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), pan-AKT (1: 1000; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA). , KI67 (1: 1000; Imọ-ẹrọ Ifilọlẹ Cell, Danvers, MA), cleaved caspase 3 (1: 1000; Imọ-ẹrọ Ifihan sẹẹli, Danvers, MA) ati β-actin (1: 2500; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ti lo bi a ti ṣalaye..Awọn filaments Actin jẹ abawọn pẹlu Acti-stain rhodamine phalloidin (Cytoskeleton, Denver, Colorado).
Awọn sẹẹli iṣakoso U2OS ati awọn sẹẹli SPECC1L-kd ni a gbin ni boṣewa glukosi giga DMEM ti o ni afikun pẹlu 10% omi ara inu oyun (Awọn Imọ-ẹrọ Igbesi aye, Carlsbad, CA).Fun awọn iyipada AJ, awọn sẹẹli 2 x 105 ti wa ni irugbin lori gilasi ti a tọju pẹlu 0.1% porcine gelatin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ati ki o ṣe akiyesi fun awọn iyipada ninu apẹrẹ sẹẹli.Awọn sẹẹli ni a gba ni oriṣiriṣi awọn aaye akoko itọkasi: Awọn wakati mẹrin lẹhin irugbin (t = 1), awọn wakati 24 lẹhin irugbin (t = 2), idapọ laisi iyipada ninu apẹrẹ sẹẹli (t = 3), iyipada ninu apẹrẹ sẹẹli (t = 4) , 24 h lẹhin iyipada apẹrẹ sẹẹli (t = 5) ati 48 h lẹhin iyipada apẹrẹ sẹẹli (t = 6) (Fig. 1, 2, 3).Lati ṣe atunṣe ọna PI3K-AKT, awọn sẹẹli ti gbin ni awọn ifọkansi itọkasi pẹlu PI3K-AKT inhibitor wortmannin (TOCRIS Biosciences, Minneapolis, Minnesota) tabi SC-79 activator (TOCRIS Biosciences, Minneapolis Adams, Minnesota).Alabọde ti o ni awọn kemikali ti yipada lojoojumọ.
Awọn igbasilẹ fireemu-nipasẹ-fireemu ni a ṣe lori iṣakoso ifiwe ati awọn sẹẹli KD labẹ awọn ipo aṣa deede, ati pe awọn aworan itansan alakoso ni a gba ni gbogbo iṣẹju mẹwa 10 fun awọn ọjọ 7.Awọn aworan ti wa ni ipasẹ nipa lilo maikirosikopu inverted Leica DM IRB kan ti o ni idari kọnputa ti o ni ipese pẹlu ipele ẹrọ ati ibi-afẹde 10 × N-PLAN kan ti o sopọ mọ kamẹra QImaging Retiga-SRV kan.Lakoko aworan, awọn aṣa sẹẹli ni itọju ni 37°C ni oju-aye tutu pẹlu 5% CO2.
Awọn laini sẹẹli ES meji jiini DTM096 ati RRH048 lati Ile-iṣẹ Ohun elo Asin Asin Ekun (UC Davis, CA) ni a lo lati ṣe ina awọn laini asin Specc11 aipe, Specc1lgtDTM096 ti a yan ati Specc1lgtRRH046.Ni ṣoki, awọn sẹẹli 129/REJ ES ni abẹrẹ sinu awọn blastocysts C57BL6.Abajade awọn eku akọ chimeric ni a sin pẹlu awọn eku abo C57BL6 lati ṣe idanimọ ọmọ pẹlu awọ aso agouti.Iwaju awọn ifibọ ẹgẹ-ẹjẹ jiini ni a lo lati ṣe idanimọ heterozygotes.A tọju awọn eku lori ipilẹ ti o dapọ ti 129/REJ;C57BL6.Ipo ti aaye ti a fi sii ti jiini pakute fekito ni a fi idi rẹ mulẹ nipasẹ RT-PCR, ilana-ara genome, ati imudara jiini (Afikun Aworan 1).Lati wa kakiri iran CNCC ti awọn eku heterozygous Specc1lGT ilọpo meji, ROSAmTmG (#007576) ati Wnt1-Cre (#003829) eku (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) ni a rekoja lati gbejade ROSAmTmG ati Wnt1-Cre allele in Specem1l.Gbogbo awọn adanwo ninu awọn eku ni a ṣe ni ibamu si awọn ilana ti a fọwọsi nipasẹ Itọju Ẹran ti Ile-iṣẹ ati Igbimọ Lilo ti Ile-ẹkọ giga ti Ile-iṣẹ Iṣoogun ti Kansas.
Awọn ọmọ inu inu inu (1% formaldehyde, 0.2% glutaraldehyde, 2 mM MgCl2, 0.02% NP-40, 5 mM EGTA) fun awọn iṣẹju 60 ni iwọn otutu yara.Lẹhin imuduro ni ojutu idoti idoti X-gal (5 mM potasiomu ferricyanide, 5 mM potassium ferrocyanide, 2 mM MgCl2, 0.01% sodium deoxycholate, 0.02% NP-40, 1 mg / ml X-gal) Idagbasoke abawọn ni a ṣe ni 37 ° C. .°C laarin 1-6 wakati.Awọn ọmọ inu oyun ti wa ni ifiweranṣẹ ni 4% PFA ati wiwo.
Fun didi Oorun, awọn sẹẹli ti wa ni lysed ni ifipamọ lysis palolo (Promega, Fitchburg, WI) ni afikun pẹlu adalu HALT protease inhibitors (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).A ṣe ilana Lysates lori 12% polyacrylamide Mini-PROTEAN TGX awọn gels ti a ti ṣetan (Bio-Rad, Hercules, CA) ati gbigbe si awọn membran Immobilon PVDF (EMD Millipore, Billerica, MA).Awọn membran ti dina ni 5% wara ni PBS ti o ni 0.1% Tween ninu.Awọn apo-ara ti wa ni idawọle ni alẹ kan ni 4°C tabi fun wakati kan ni iwọn otutu yara.Femto SuperSignal West ECL reagent (Thermo Scientific, Waltham, MA) ni a lo fun iran ifihan.Fun ajẹsara ajẹsara, awọn ọmọ inu oyun ni a ṣeto ni alẹ kan ni 4% PFA/PBS ati ki o tọju igbe.Tissue cryosections ti dina ni PBS ti o ni 1% deede ewúrẹ omi ara (Thermo Scientific, Waltham, MA) ati 0.1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ati ki o si incubated ni 4 ° C ni ohun incubator nigba akoko. ale.pẹlu egboogi-egboogi ati fluorescent secondary antibody (1:1000) fun wakati kan ni 4°C.Awọn abala ti o ni abawọn ni a gbe sinu alabọde goolu ProLong (Thermo Scientific, Waltham MA) ati awọn aworan alapin ni a gba ni lilo maikirosikopu confocal Leica TCS SPE kan.Ajẹsara ajẹsara kọọkan ni a ṣe bi awọn adanwo ominira mẹta lori awọn iyipo ti o kere ju awọn ọmọ inu oyun meji.Aṣoju adanwo ti han.
Awọn sẹẹli ti wa ni idalẹmọ RIPA ti a ṣe atunṣe (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1% NP-40, 130 mM NaCl, 10% glycerol, 2 mM EDTA, ati HALT protease inhibitor (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) Ni ṣoki, awọn lysates ni a ti sọ di mimọ pẹlu amuaradagba G magnetic beads (Awọn imọ-ẹrọ Igbesi aye, Carlsbad, CA) ati lẹhinna wọ inu oru alẹ ni 4 ° C. pẹlu egboogi-SPECC1L tabi awọn ilẹkẹ amuaradagba IgG protein G ni a lo lati yọ SPECC1L jade ati pe a ṣe ifọpa Iwọ-oorun nipa lilo egboogi -β-catenin antibody ti a ṣalaye loke Awọn adanwo àjọ-IP ti o han jẹ aṣoju ti awọn adanwo ominira mẹrin.
Awọn sẹẹli ti o wa titi tabi awọn iṣan oyun ti asin ni a pese si ile-iṣẹ microscopy elekitironi ni Ile-ẹkọ giga ti Ile-iṣẹ Iṣoogun Kansas.Ni soki, awọn ayẹwo ti wa ni ifibọ ni EMbed 812 resini (Electron Microscope Sciences, Fort Washington, PA), polymerized moju ni 60 ° C, ati apakan ni 80 nm nipa lilo Leica UC7 ultramicrotome ti o ni ipese pẹlu abẹfẹlẹ diamond kan.Awọn apakan ni a ṣe ojulowo nipa lilo maikirosikopu elekitironi gbigbe JEOL JEM-1400 ti o ni ipese pẹlu ibon 100 kV Lab6 kan.
Bii o ṣe le ṣalaye nkan yii: Wilson, NR et al.Aipe ti SPECC1L nyorisi iduroṣinṣin ti o pọ si ti awọn isẹpo spliced ​​ati idinku delamination ti awọn sẹẹli crest neural cranial.ijinle sayensi.Ọdun 6, ọdun 17735;doi: 10.1038 / srep17735 (2016).
Saint-Jeanne, J.-P.Ifilọlẹ ati iyatọ ti crest neural.(Springer Science + Business Media; Landes Bioscience/Eurekah.com, 2006).
Cordero, DR et al.Awọn sẹẹli Cranial Neural ni išipopada: ipa wọn ninu idagbasoke craniofacial.Iwe akọọlẹ Amẹrika ti Awọn Jiini Iṣoogun.Apakan A 155A, 270–279, doi:10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
Boland, RP Neurocristopathia: idagbasoke ati idagbasoke rẹ ju ọdun 20 lọ.Oniwosan ọmọde.Ẹkọ aisan ara.yàrá.òògùn.17, 1–25 (1997).
Mangold E., Ludwig KU ati Noten MM Breakthrough ninu awọn Jiini ti orofacial clefts.Awọn aṣa ni Isegun Molecular 17, 725-733, doi: 10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011).
Minu, M. ati Riley, Awọn ọna ẹrọ Molecular FM ti iṣilọ sẹẹli crest neural cranial ati apẹrẹ lakoko idagbasoke craniofacial.Idagbasoke 137, 2605-2621, doi: 10.1242 / dev.040048 (2010).
Dixon, MJ, Marazita, ML, Beaty, TH ati Murray, JK Cleft lip and palate: agbọye jiini ati awọn ipa ayika.adayeba ọrọìwòye.Awọn Jiini 12, 167-178, doi: 10.1038 / nrg2933 (2011).
Ingram, CR et al.Mofogenesis ajeji ti awọ ara, awọn ẹsẹ, ati agbegbe craniofacial ni interferon-regulating factor-6 (Irf6) -eku aipe.Genette orilẹ-ede.38, 1335-1340, doi: 10.1038/ng1903 (2006).
Peyrard-Janvid, M. et al.Awọn iyipada ti o ni agbara ni GRHL3 nfa iṣọn-ara van der Waord ati ailagbara idagbasoke ti agbegbe ẹnu.Am J Hum Genet 94, 23-32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014).
Harris, MJ ati Juriloff, DM Ṣe imudojuiwọn atokọ ti awọn ẹda asin pẹlu awọn abawọn ni pipade tube nkankikan ati ilọsiwaju si oye jiini pipe ti pipade tube nkankikan.Iwadi ti awọn abawọn ibi.Apá A, Isẹgun ati Itọju Ẹjẹ 88, 653-669, doi: 10.1002/bdra.20676 (2010).
Fantauzzo, KA & Soriano, P. PI3K-mediated PDGFRalpha ifihan agbara ṣe ilana iwalaaye ati ilọsiwaju ni idagbasoke egungun nipasẹ ọna-ọna intracellular ti o gbẹkẹle p53.Gene Development 28, 1005-1017, doi: 10.1101 / gad.238709.114 (2014).
Kopp, AJ, Green, ND ati Murdoch, JN Disheveled: Ibasepo ti imugboroja convergent si pipade tube nkankikan.Awọn aṣa ni Neurology.26, 453-455, doi: 10.1016 / S0166-2236 (03)00212-1 (2003).